五步蛇雌雄异体，外表上无明显区别。一般雄性尾基部略膨大，尾较雌性略长(尾下鳞略多些)。五步蛇出生后2～3年性器官已发育成熟，小型蛇较大型蛇成熟快，生活在寒冷地区的蛇成熟比热带的蛇要慢。五步蛇是体内受精的动物，交配期一般在春末夏初出蛰后进行，秋冬之交配现象较少。各种蛇类的生殖季节不尽相同，如眼镜蛇的交配期一般是在4～6月；银环蛇多在8～10月；尖吻蝮在10～11月；蝮蛇和蝰蛇在5～9月等。雄蛇有一对交接器，在肛孔两侧，由内向外翻出。每次交配时，只使用一侧的交接器，交接器平时藏在雄蛇尾基部内。在交接时伸出来，交接器上有倒钩和棘状突起，如翠青蛇的雄性交接器端膨大，每个棘上生有若干棘突(图6)。
雌蛇性器官发育成熟时，游到外面的草丛中，不断地将性腺分泌的激素释放出来，雄蛇接到求偶信号后会立即顺着雌蛇尾基部性腺释放出来的性外激素寻找到雌蛇，伏在雌蛇身上，而雌蛇伏地不动，有时雌雄蛇还把身子直立起来。当雄蛇交接器插入雌蛇泄殖腔时，情绪异常激动，不断摇头摆尾并主动缠绕雌蛇，蛇交配时其性情要比平时暴躁，这时若遇外面的惊扰，会发出猛烈的攻击。1条雄蛇可与多条雌蛇交配，而雌蛇只交配1次，通常不再与第2条雄蛇交配。在人养饲养条件下，平时应将雌雄分开饲养，到交配期才将雄蛇放刮雌蛇群中。一般性别比例以雄雌比例为1：9～10较为合适，交配期过后再将雌蛇分开饲养。各种蛇的交配时间长短也不相同，一般交配时问为半小时以上；有的延续数小时，长的可达24小时。据资料报道，成都动物园曾观察到饲养的黑眉锦蛇交配时间从上午8时到下午7时，延续11小时之久。蛇交配后不一定立即发生受精作用，精子可在雌体输卵管里存活4～5年，人工饲养的雌蛇交配1次后可连续3～4年产出受精卵。例如眼镜蛇的交配期在4～6月，翌年6～8月产卵；银环蛇的交配期在6～8月，翌年5～8月产卵；尖吻蝮的交配期在10～11月，翌年6～8月产卵；蝰蛇的交配期在5～7月，翌年8～10月产卵。
