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蛇毒中激肽释放酶

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   2015-04-06 2200
核心提示:(一)概述激肽释放酶全称为舒缓激肽释放酶,又称激肽原酶。注射响尾蛇毒引起的明显作用就是能降低动物的血压。RochaeSilva等(1949)发现美洲矛头蝮蛇毒可以从人优球蛋白释放一种生理活性物质,

(一)概述

激肽释放酶全称为舒缓激肽释放酶,又称激肽原酶。注射响尾蛇毒引起的明显作用就 是能降低动物的血压。Rocha e Silva等(1949)发现美洲矛头蝮 蛇毒 可以从人优球蛋白释放一种生理活性物质,并将这种物质称为舒缓激肽,具有降压的功 能。由于响尾蛇毒中蛋白水解酶活性很大,所以过去人们认为从激肽原释放出激肽是由其 中内肽酶作用的结果。后来Deutsch和DiniZ(1955)报道蛋白质被水解与激肽释放活性之 间没有确切的关系。Hamberg等(1957)发现 蛇毒即使在100℃加热 3min〜5min后仍然保持释放舒缓激肽和促凝活性。此后,激肽释放酶也在哺乳动物的血 浆及某些腺体中找到,分别被称为血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。激肽释放酶在体内 有重要的生理功能,它不但能释放激肽,还能激活凝血因子XII而参与凝血反应,与补体系 统也有密切关系。激肽释放酶释放的激肽具有使毛细血管舒张、血压下降、平滑肌收缩和 致痛等强烈的生理效应。激肽释放酶与激肽原、激肽与激肽酶等共同组成了激肽释放酶一激肽系统,认清这一系统的作用在理论上和在临床医学上也具有重大意义。现在知道所有 响尾蛇毒和蝰蛇毒中都含有激肽释放酶,这种酶可以作用于血浆中的激肽原而释放舒缓 激肽。它们与蛇毒中其他精氨酸酯酶和类凝血酶不同,当以合成底物baee,bame和 TAME为底物时,它们的水解活性比精氨酸酯酶和类凝血酶的水解活性要低得多。Oshi- ma等(1969)研究了蝮亚科、蝰蛇科和眼镜蛇科32种蛇毒的精氨酸酯酶及激肽释放酶的 活性,指出激肽释放酶在蝮亚科蛇毒中活力较高。

(二)分离、纯化和理化性质

自从1949年Rocha e Silva等人首先在美洲矛头蝮蛇(£0认ro% jararaca)蛇毒中发 现激狀释放酶之后,很多学者对蛇毒激肽释放酶做了大量的分离工作,并对它们的物理化 学性质进行了研究。1965年,Sato等人从日本複蛇蛇毒中分 离纯化出激肽释放酶,并对它的物理化学性质进行了研究。过去还对下列蛇的蛇毒的激肽 释放酶进行了纯化:美洲矛头蝮 、西部菱斑响尾蛇 、锯鳞蝰 和加蓬四蝰 。对这些蛇毒中激肽释放酶的分离多采用 DEAE-Cellulose,CM-CellUl0Se或羟基磷灰石反复层析以除去破坏激肽的酶和其他精氨 酸酯酶。所有上述蛇毒中都含有两种激肽释放酶,这两种酶可以用Sephadex G-75或 DEAE-Cellulose柱层析分开,二者的区别还不清楚,但其中的一种分子量可能较小。

近10年来对蛇毒激肽释放酶的分离也较多。Bailey等(1976)和Viljoen(1979)从沙 蜂和加蓬啦蜂 蛇毒中分离出了激肽释放 酶。Sugihara等(1981,1982)对恪铁头 蛇毒中激肽释放酶进行了研 究。王心民等(1984)发现浙江产蝮蛇Pallas)蛇毒中含有激肽释放酶, 不需活化即可水解激肽原,释放激肽,并具有弱的精氨酸酯酶的活力。粗毒经DEAE-纤维 素、DE-22、DE - 52和Sephadex G-75分离纯化后,可得到两个激肽释放酶的组分:I与 I,二者电泳行为与酶活力有所不同,激肽释放酶I在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈一条带, 而组分I中还杂有少量的组分I。激肽释放酶I为一糖蛋白,含糖量20. 3%,约由221个 氨基酸残基组成,凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31 000和30 000。此酶具有 严格的底物专一性,能作用于激肽释放酶的专一底物Z-Phe-Arg - MCA及Bz-Pro-Phe- Arg-PA,不作用于一般蛋白质底物酪蛋白,对TAME的水解速度仅是对BAEE水解速 度的14%,以BAEE为底物时,其最适pH为8〜9,Km值为2. 85Xl0-4mol/L。pH低于5 或大于9,温度在40°C以上时,酶活力迅速下降。其精氨酸酯酶及激肽释放酶的活力均能 被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP所抑制,两者呈平行关系,但都不被胰蛋白酶的专 一抑制剂TLCK所抑制。慈菇抑制剂与大豆胰蛋白酶抑制剂对此酶有部分抑制作用。经磷 酸纤维素等阳离子交换树脂层析或交联的慈菇抑制剂Sepharose 4B亲和层析也能提纯 激肽释放酶I,但提纯后精氨酸酯酶活力下降,激肽释放活力几乎全部丧失。经圆二色光 谱测定表明,酶的构象已发生改变。对激肽释放酶I作用于激肽原后的产物作了鉴定,证 实是舒缓激肽。

Ohtani等(1983)从 蛇毒中纯化出一种能引起毛细血管通透性增大的蛋白酶。从4g粗毒中可以纯化6. 2mg这种蛋白酶,纯化的蛋白质在pH8. 3和PH4. 5条 件下进行PAGE测定为纯蛋白,该酶无酪蛋白水解活性和促凝活性,但能水解TAME,说 明具有精氨酸酯酶活性。注射Spg该酶到家兔皮内可以发现毛细血管的通透性增加。0- htaini等(1985)再进一步研究发现这种酶与牛血浆混合,注射到去毛的家兔背部皮内后, 其毛细血管通透性增加的强度比单独注射该酶大。用50%〜70%的乙醇对混合物(酶和 牛血浆)进行抽提后,如果再用羧肽酶A对该提取物进行处理,其活性即丧失,因此认为 这种酶对毛细血管透性的增加作用是由于它作用于牛血浆中的某种蛋白,释放出小分子 量肽的缘故。没有发现有其他物质如组胺和过敏素等的释放,也没有发现对补体系统有作 用。Ohtani等(1988)对毛细血管通透性增强因子的理化性质作了进一步的研究。研究表 明:该因子用SDS-PAGE测定时分子量为32 000,由266个氨基酸残基组成,芦一条狀 链,含糖量为11. 4%,等电点为4. 8。这种酶比哺乳动物中丝氨酸型蛋白酶有更^广泛的底 物,能水解精氨酸酯和赖氨酸酯,但水解前种底物的活性较高,它不能水解酪氨酸酯。DFP 可以同时抑制它的精氨酸酯酶和毛细血管通透性增加活性,说明这种酶是以丝氨酸作为 活性中心的丝氨酸蛋白酶。对它的最适pH和热稳定性也作了大致的研究,该酶在pH7〜 9范围内稳定,在5(TC以上酶失去活性。在从九蛇毒中分离出毛细血管通透 性增加因子的同时,Ohtaini等(1988)还从该蛇毒中分离出一种激肽释放酶,在PH8. 3条 件下用PAGE法和SDS-PAGE法测定为纯品。该酶无酪蛋白水解活性和促凝活性,但能 从牛高分子量激肽原中释放出舒缓激肽。把这种蛋白质注入到家兔皮内会增加毛细血管 的通透性。一般认为它的增加毛细血管通透性作用与它的舒缓激肽释放作用有关。对该 酶的物理化学性质进行研究发现,该释放酶是含糖的单链肽,糖的含量为10. 1%,分子量 为33 500,由274个氨基酸残基组成,等电点为3.5。释放酶水解精氨酸酯的速度比水解 赖氨酸酯快,不能水解酪氨酸酯。DFP能抑制它的精氨酸酯酶活性,也能抑制从牛高分子 量激肽原中释放激肽,这说明该酶的活性部位有丝氨酸残基。该酶还能水解PNA,H . D . Phe-Pipecolyl-Arg-PNA、H .Pro-Phe-Arg-PNA、H *D .Val-Leu-Arg-PNA 和 Pro-Phe-Arg-4-Methylcoumary-7-Amide,这说明这种酶的底物比动物中的丝氨酸蛋白 酶更少。

Schwartz等(1985)从Crote/w5 蛇毒中分离出两种酶,这两种酶的氨基酸含量相似,都含有糖类,分别称为AAE I和AAE I,它们的最适pH值在 8. 0〜8. 5范围内,都不能水解酪蛋白、血红蛋白和BAPNA,但都能水解BAME、TAME 和Ac-Phe-Arg-OMe。酶的活性可以被丝氨酸修饰剂和苯甲酰胺抑制,但EDTA和大豆 胰蛋白酶抑制剂不抑制其活性。两种酶都无类凝血酶活性,但都能释放激肽,这可以通过 分离的小鼠子宫收缩来证明。AAE I和AAE I的N-端氨基酸顺序相同,而且与从其他响 尾蛇毒中分离出来的精氨酸酯酶相似。

Samel等(1987)从极北蜂(V7/>ct"<2 term)蛇毒中分离出两种精氨酸酯水解酶,命名为E I和EI。这两种酶都是由同工酶组成的混合物,E I的等电点在4.0〜4. 6范围 内,£1的等电点在3.3〜3.9范围内。同工酶的分子量相等,用303^八0£测定£1分子 量为38 500,En分子量为41 000。两种酶的N末端氨基酸都为缬氨酸,它们的氨基酸含 量也十分相似,都含有糖类。如用神经氨酸酶处理E I和E I后,两种酶在等电聚焦电泳 系统中的迁移速度相近。这两种酶对酪蛋白和BAPNA都无水解作用,但都能水解 BAEE、TAME和Pro-Phe-Arg-ACA。它们的酯酶活性可以被有机磷和苯甲酰胺抑制,大


豆胰蛋白酶抑制剂也有轻微的抑制作用。E I水解BAEE的Km为3.3X105mol/L,水解 TAME 的 Km 为 3. 0105mol/L,E I 水解 BAEE 和 TAME 的 Km 值为 2. 7X105mol/L 和5. 9X105mol/:UE I具有激肽释放反应,可以引起分离的小鼠子宫收缩。E I的生理作 用还不知道,这两种酯酶均无类凝血酶和纤维蛋白原溶解酶的活性。

Komori等(1988)从毒蝰蛇毒中分离出一种类似于激肽释放酶 的酶,是分子量为43 000的糖蛋白,等电点为4.1。它具有精氨酸酯酶活性,但对二甲酰 酪蛋白或纤维蛋白原无水解活性,与牛血浆作用后的混合物能引起分离的小鼠子宫收缩, 说明它能从牛血浆蛋白中释放激肽。2. 36mg酶在lmin可以释放lfxmol/L舒缓激肽。该 酶还可以引起毛细血管通透性增加,降低血压;以用人工合成的激肽原类似物Ser-Leu- Met-Lys-Arg-Pro-P)"0-Gly-Plie-Ser-Pro-Phe-Arg-Ser-Val-Gly-Val-Ser 为底物时,该酶 可以水解产生舒缓激肽和赖氨酰舒缓激肽,这进一步说明它具有类似激肽释放酶的活性。 该酶对子宫的收缩作用、毛细血管通透作用和精氨酸酯酶活性可以被DFP抑制,这说明 酶中的丝氨酸羟基是酶活性和生物活性必须的。抗凝血酶I、肝素和血浆中发现的丝氨酸 蛋白酶抑制剂对该酶无影响。已经对该酶的N-端氨基酸顺序进行了分析,与其他蛇毒中 的激肽释放酶以及猪胰激肽释放酶的N-端相似。

除上述介绍的以外,Bjarnason等(1983)从西部菱斑响尾蛇(Crota/奶 afmr)蛇毒中, Markland等(1982)从东部菱斑响尾蛇(CVo印蛇毒中,Siigur等(1982)从地 中海蜂蛇毒中分别纯化出了激肽释放酶或类似物,有关它们 的详细情况可查看有关文献。

总的来说,激肽释放酶都比较稳定,在冰冻状态下至少可以稳定保存6个月,冻干过 程中不会影响酶的活性。该酶对热也较稳定,但如用沸水浴加热20min,其活性完全消失。 从加蓬U丝蜂(5to )和银鳞蝰(b can'watos)蛇毒中分离出来的激肽释放酶分子量分别为33 500和22 000。多数激肽释放酶是糖蛋白。对中国浙江蝮蛇Pallas)蛇毒中的激肽释放酶I的氨基酸组成研究发现,它含有丰富的谷氨酸和甘 氨酸,含量较高的是天门冬氨酸,等电点测定也属于酸性蛋白,共含有221个氨基酸残基, 糖含量为20. 3% ,其中中性糖8. 0%,唾液酸1. 8%,氨基己糖为10. 7%。与其他激肽释放 酶相比,它的稳定性要差得多。将激肽酶I分别于不同温度下保温3h,然后测定水解 BAEE的活力,结果表明,激肽释放酶在30°C以下比较稳定,超过40€活力迅速下降。将 激肽释放酶I分别溶于不同pH的0. lmol/L缓冲液中,配成0. 3mg/ml酶液于室温 (25D静置24h后测定水解BAEE活性,结果表明酶在pH5. 0〜9. 0之间稳定,而在 PH5. 0以下或9. 0以上活力则明显下降。这说明这个酶对酸、碱都不稳定,这一点与日本 蝮蛇及哺乳动物组织激肽释放酶相似。

激肽释放酶的最适pH为8. 5〜9. 0,在这种条件下水解BAEE和释放激肽的活性最 强。阳离子(^2+^82+、^[112+、2112+丄£12+和?62+对激肽释放酶的活性无任何影响,但它 可以被DFP和胰脏碱性胰蛋白酶抑制剂抑制。这两种抑制剂不能抑制从加蓬咝蝰(£/沿 蛇毒中分离出来的激肽释放酶。激肽释放酶释放激肽作用可以被合成底物 BAEE、TAME抑制,抑制的程度与这两种底物的浓度有关。

 
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