蛇毒中作用于羧酯键的酶

蛇毒中含有水解羧酯键的酶类，水解的底物为磷脂、乙酰胆碱和芳香乙酸酯。这类酶 包括3种:即磷脂酶、乙酰胆碱酯酶和芳香酯酶。蛇毒中的精氨酸酯酶虽然也能水解人工 合成的精氨酸或赖氨酸酯，但它更主要的是水解自然界中的蛋白质肽键，所以属于蛋白酶 类。这里讨论的酶类只作用于酯类底物，不能对任何肽键起作用。在这类酶中，乙酰胆碱 酯酶和磷脂酶的生物学功能较重要，已得到充分的研究。有些蛇毒有很强的芳香酯酶活 性，它们能水解对-硝基苯乙酯、a-或P-萘乙酸酯和吲哚乙酯。现在还不知道这种活性是由 独立的酶产生的还是已知的羧酸酯酶的副作用，更不知道这种酶的生物学意义是什么。用 日本蝮蛇 蛇毒与底物对-硝基苯乙酯、吲哚乙酯反应，没有发现有水解 产物对-硝基苯酚和吲哚酚;相反，这些酯如果与眼镜蛇舟山亚种 蛇毒和 银环蛇 蛇毒作用则会很快被水解。已知这些眼镜蛇毒有很强的 胆碱酯酶活性，水解上述底物可能是由这种酶的作用。事实上，Mclean等(1971)报道，很 多属于眼镜蛇科的蛇毒都能水解吲哚乙酯、萘乙酯和萘丁酯，这些蛇毒来自：眼镜蛇  、黑颈眼镜蛇 、黑唇眼镜蛇   、金黄眼镜蛇  、埃及眼镜蛇 、眼镜王蛇  、金环蛇  曼巴蛇黑曼巴蛇和白唇曼巴蛇(D. aw尽现在还知道东部菱斑响尾蛇 

蛇毒能水解甲基吲哚乙酯，这种底物是测定血清中胆碱酯酶活性的底物，但这种 蛇毒没有表现出胆碱酯酶活性。这说明眼镜蛇毒中存在一种未知酯酶，它不同于胆碱酯 酶，要想搞清这种酶的本质，还要做进一步的分离工作。

一、磷脂酶A2

(—)概述

磷脂酶是指能够水解磷酸甘油酯的酶。自然界中有5种磷脂酶，即磷脂酶A2、磷脂酶

A,、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D。蛇毒中主要含磷脂酶A2(PLA2)，有极少数蛇毒含磷 脂酶B,其他几种磷脂酶主要在动物组织和细菌中。图3-11-4说明了这几种磷脂酶对底 物水解的作用部位。 

     在磷脂酶中，PLA2研究得较多，它可能是蛇毒中研究最多的一种酶，它的底物为Sn- 3-磷酸甘油酯          第2位上的酯键。这种酶广泛存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒和动物组织中，四科蛇 毒中均含有丰富的PLA2。由于这种酶使红细胞破裂引起溶血，所以也把它称为“溶血 素”，也有人把PLA2称为溶血卵磷脂酶。

Ludeeke首先发现蛇毒通过酶可以对卵磷脂作用产生一种溶血性化合物，后来 Delezenne等人证明当眼镜蛇毒作用于马血清或卵黄时形成一种溶血物质。现在知道 PLA2可以直接作用于红细胞膜的磷脂，破坏红细胞膜的结构而引起直接溶血作用；也可 以作用于血清或添加的卵磷脂产生溶血卵磷脂,后者作用于红细胞而产生间接溶血。尽管 四科蛇毒中都含有丰富的PLA2，但各种蛇毒中酶的含量稍有不同，响尾蛇(C.

蛇毒仅仅显示弱的PLA2活性。表3-11-11例举了我国10种主要毒蛇蛇毒 PLA2的活性比较。

表3-11-11我国10种蛇毒磷脂酶八2活力的比较

(二）分离和纯化

蛇毒中PLA2的含量较大，而且对热、酸、碱和变性剂稳定，这样使它们很容易被纯 化分离PLA2常用的方法是先对粗毒进行凝胶过滤，然后进行离子交换层析，后一步可 以重复进行。需要注意的是，在离子交换层析后对PLA2进行冷冻干燥应该注意不要引起 的聚集，因为冷冻干燥过程中往往使体系中离子强度增大，而离子强度大是引起 PLA2聚集的重要因素。除上述一般方法外，下面一些方法也有被采用:①Wells等(1975) 用异丙醇和NdCl3沉淀法从东部菱斑响尾蛇 如蛇毒中纯化出了 PLA2。②用PLA2的底物类似物为配基进行亲和层析。这种配基可以与蛇毒中结合有Ca2+的PLA2结合。洗脱液多采用EDTA，除去Ca2+后的PLA2与配基 的亲合力减小，可以从配基上解离出来。也有人用30%的有机溶液或6mol/L尿素作为洗 脱液。③用PheiiylSephar0SeCL-4B进行疏水层析，以除去心脏毒素中的微量PLA2。④ 以抗PLA2的抗体作配基对PLA2进行亲和层析。

迄今为止已经有大量的蛇毒PLAZ被纯化出来。Tu等(1977)列出了 1975年以前从 蛇毒中纯化出的PLA2。近几年，每年都有大量报道分离、纯化PLA2的文章，在这里着重 讨论我国学者对PLA,的分离纯化工作。

陈远聪等(1981)从浙江蝮蛇毒中分离出3种PLA2，按其等电点划分，可分为酸性、中 性和碱性PLA2。按其毒性划分，毒性较大的是中性PLA2，已鉴定为突触前神经毒素—— 蝮蛇毒素(Agkistrodotoxin),毒性较低的是碱性PLA2,酸性PLA2几乎没有毒性。武祥福 等(1984)比较了 3种PLA2的特性，包括分子量、氨基酸组成、N末端、等电点、热稳定性、 酶活性、毒性和溶血活性等.结果表明，它们有相似的分子量和热稳定性，但在其他方面却 有显著的差别。在酶活性方面，酸性酶活性较高，碱性酶活性最低;对大白鼠红细胞的溶血 作用碱性酶最强，中性酶次之，酸性酶几乎不溶血。因此推测PLAZ的溶血效应与PLA2 分子的电荷有关。张景康等（1981)已经制出了 Agkistrodotoxin的晶体。涂光俦等 (1983)报道从福建产圆斑蝰蛇毒中分离纯化了一个等电点为7. 6的毒性PLA£，并测定了 它的部分理化性质、氨基酸组成及N-端22个氨基酸残基的排列顺序。李跃生等(1985)从 福建产圆斑蝰蛇毒中分离纯化出另一种PLA2。该PLA2*子量为13 800,等电点10. 4,比 活力为35/xnioI/miri . mg。以卵磷脂为底物，酶的最适pH为8. 0,最适温度为65°C。小鼠 静脉注射的LD5。为0. 5士0. 12mg/kg。此酶具有明显的抗凝性和溶血作用。该毒性PLA2 分子由18种氨基酸的123个残基组成，分子中富含半胱氨酸(14)、天冬氨酸(14)和甘氨 酸(12)，但只含1个甲硫氨酸，其N末端为丝氨酸残基。与涂光俦分离的PLA2相比，2种 同工酶的分子量和氨基酸残基数目十分相近，氨基酸组成也很相似，但天冬氨酸和脯氨酸 残基的数量有一些差异。广西眼镜王蛇 蛇毒含有丰富的PLA2,舒 雨雁等(1989)从该毒中分离出一种PLA2,比活性较原毒提髙3. 6倍，分子量为13 000, 由122个氨基酸残基组成，等电点为8. 9,具有良好的热稳定性。从碱性PLA2对红细胞影 响的电镜观察可见，对人的红细胞膜有明显的作用，而对山羊红细胞作用不明显，该 PLA2无论对人还是对山羊、兔和豚鼠红细胞电泳速度都有明显的迟缓作用。Chen等 (1989)最近从尖吻蝮 蛇毒中分离出一种酸性PLA2,用凝胶过滤测 定的分子量为16 900，SDS凝胶电泳测定的分子量为16 400,等电点为4. 9,该酶N端的10个氨基酸顺序与从响尾蛇科其他来源的PLA2相似。该酶能抑制由ADP、胶原蛋白和 花生四烯酸钠诱导的血小板聚集，当PLA2浓度在10/xg/ml〜lOOjug/ml时，血小板聚集 彻底被抑制。如果用洗涤的血小板为材料，PLA2在20Mg/ml浓度也不能抑制聚集。阿斯 匹林是环氧酶的抑制剂，可以抑制PLA2对血小板的作用，PLA2可能是通过水解出花生 四烯酸合成血栓素A2来抑制血小板的聚集作用的。用圆二色性、荧光、紫外光吸收等手 段研究了浙江产蝮蛇毒碱性PLA2的溶液构象，实验结果显示此酶的主链构象和其他种 属来源的同类酶相似，骨架构象具良好的抗热性，在酸性环境中产生的构象变化为可逆 的。激活剂Ca2+和酶的结合不影响色氨酸残基的环境，抑制剂，Zn2+则与此相反。溶液pH 值影响酶活性的方式与上述试剂不同。