(―)概述
乙酰胆碱酯酶存在于某些鱼类的电器官的神经组织、动物血清、红细胞和视网膜中， 眼镜蛇毒和海蛇毒中也含有此酶。由于乙酰胆碱酯酶在神经传导方面的重要作用，早在本 世纪初期就受到生化工作者的注意。关于动物组织中乙酰胆碱酯酶的纯化及其性质的研 究已有大量报道和综述。动物组织或细胞中的乙酰胆碱酯酶都是以不溶的形式存在。提 取这些酶首先必须把该酶从颗粒上溶解下来，常采用表面活性剂和高盐溶液处理，但是这 样处理后的酶有些在离开原来体系后有聚合现象，还可能导致酶的细微结构变化。蛇毒中 的胆碱酯酶是一种可溶性的酶，因而对它的纯化可免去这些处理，使用更为温和的手段， 对用这种方法纯化的酶进行研究可能更接近酶的天然状态。
蛇毒中的乙酰胆碱酯酶较先由Iyenger等(1938)在眼镜蛇毒中发现。以后的研究表 明这种酶只在海蛇毒和眼镜蛇毒中存在，响尾蛇毒和蝰蛇毒中极少有这种酶。Nachman- sohan (1942)发现眼镜蛇毒显示的乙酰胆碱酯酶活性比电鳗组织中该酶活性高100倍。 过去曾认为这种酶与眼镜蛇毒的神经毒性有关，但用电泳法把眼镜蛇毒和金环蛇毒的胆 碱酯酶与其他组分分开后，发现胆碱酯酶不再具有神经毒性。现在已知道眼镜蛇毒的神经 毒性由其中的神经毒素引起，与乙酰胆碱酯酶无关，乙酰胆碱酿酶的功能还有待于进一步 研究。
该酶按下列方式催化乙酰胆碱酯水解：
CH3 0 CH3
CH3—N+—CH2—CH2—o—c—CH3 —- CH3—N+—CH2—CH2—OH + CH3COOH
/
ch3 ch3
(二)分离、纯化和理化性质
在Iyenger等（1938)在眼镜蛇毒中发现乙酰胆碱酯酶后，Zeller等（1948)进一步研 究证明这种酶主要存在于眼镜蛇毒中，而响尾蛇毒和蝰蛇毒中没有这种酶。人们已经对多 种眼镜蛇的蛇毒中乙酰胆碱酯酶进行了纯化，并研究了它们的物理化学性质，其中包括: 金环蛇 、银环蛇 、眼镜蛇丹山亚种（.和眼镜蛇外里海亚种 。
过去对N. 和 蛇毒中乙酰胆碱酯酶的纯化多使用Na2S04 和（NH4)2S04分步沉淀，后来，Kumar等（1973)用DEAE-Cellulose离子交换和亲和层 析相结合的方法对该酶进行纯化，获得了纯品。Kumar所用的亲和胶为联接有三甲基- (m-氨基苯-)-氯化铵的Sephar0Se4B凝胶，用这种方法纯化 蛇毒中的乙酰 胆碱酯酶的获得率高达59%。
5. 蛇毒中的酶在2℃〜4℃条件下贮存几个星期不影响活性，一16°C冰冻保存也稳定。该酶的分子量大约为126 000,可被8mol/L尿素(含lmol/LNaCl)分离成 两个大小相同的亚基,说明这个酶是寡聚酶。利用氨甲酰试剂邻-硝基苯-二甲基氨基甲酸 滴定乙酰胆碱酯酶，发现每个酶分子活性部位有二个，这与上述结果相同；采用负染色电 子显微镜法观察从凡蛇毒中分离出的乙酰胆碱酯酶，发现基本亚基是圆形的， 直径5.0nm，亚基可以聚合形成四聚体，但最经常观察到的是二聚体。该酶的氨基酸组成 已经被分析出来，有趣的是竟与电鳗乙酰胆碱酯酶的组成相似。从蛇 毒中分离出的乙酰胆碱酯酶的最适pH为8. 5,浙江蝮蛇 蛇毒中该酶的最适pH为7. 5。两者的最适反应温度都在38X：〜40'C范围内。纯酶不仅水解乙酰胆碱， 而且水解其他酯类化合物，包括乙酰硫胆碱（Km=16. 6X10_6m0l/L)、乙酰-J3-甲酰胆碱 (516. 6umol/L)、丙酰胆碱（33. l)umol/L)、醋酸苯酯（1. 14mmol/L)和靛醋酸苯酯（33. lmmol/L)。该酶较好的底物是乙酰胆碱，其次是乙酰硫胆碱。在底物浓度过高时，酶的活 性受抑制，也能被DFP毒扁豆碱、咖啡因（咖啡碱)和吗啉抑制。三甲基-(m -乙酰苯胺)碘 化胺是金环蛇毒乙酰胆碱酯酶的竞争性抑制剂(Ki = 76.7um0l/L)。
我国余微明等（1981)用亲和层析法对浙江眼镜蛇毒乙酰胆碱酯酶进行了纯化。纯化 后的酶活力比粗毒提高了 440倍，比活力达到230mmol/mg . h。亲和吸附剂的制备是以 Sepharose 4B为载体，己二胺为手臂，（间-羧基苯基)-二甲基乙基碘化铵为配基制成。不 同长度的“手臂”对酶的吸附有影响，烷基越长，吸附得越牢，疏水性强的“手臂”对酶的吸 附也强。屈贤铭等(1981)对该酶的理化性质进行了研究，发现其反应的最适pH为7. 5,反 应5min时的最适温度在38°C〜39€之间，Km值是1.25mol/L，稀酶溶液不稳 定，0. 1%的白明胶有利于酶的稳定。粗毒和纯化后的胆碱酯酶的底物抑制图形以及Km 值类似，这说明纯化过程中酶没有矫变。分离的酶能被多种有机磷化合物(如DEP、敌敌 畏、对氧磷)所抑制，一些氨基甲酸酯和含季铵盐的化合物也表现出抑制作用。从浙江眼镜 蛇毒中分离出的乙酰胆碱酯酶是由几种同工酶组成的，用Sephadex G-200凝胶过滤可以 把这种酶分成两个对称的酶活力峰，而且与蛋白峰完全吻合。用凝胶电泳后经蛋白染色可 见3条左右蛋白带，酶染色可见6条带。即使两次亲和层析后的制品仍然如此，免疫扩散 和免疫电泳也都说明了同一结果。邱雪贞等(1984)证明，这些同工酶并非由于在提纯或电泳过程中产生的矫变,而是原来就存在于粗毒中的。实际上，眼镜蛇科蛇毒乙酰胆碱酯酶 有同工酶早有报道，Lee等人用凝胶电泳法测定从黑唇眼镜蛇（蛇毒 中分离出的乙酰胆碱酯酶，发现有2条同工酶带;从眼镜蛇 金环蛇
蛇毒中测有4条同工酶带，在等电聚焦中分别为8条、10条。这些同工酶 分子量相同，只是电荷不同。浙江眼镜蛇毒无论是蛇毒干粉或纯化得到的酶，在凝胶电泳 上都可分离得到6条带。6条带之间分子量可能并无显著差别，而只是电泳行为不同，至 于不同形式胆碱酯酶结构和功能的关系尚待进一步研究。
Tan等（1988)从紫棕烙铁头 蛇毒中部分纯化出一种乙酰胆碱酯酶。该酶分子量为58 600,其活性能被毒扁豆碱和水杨酸盐强烈抑制。如底物浓度过 高，也能部分抑制其活性。紫棕烙铁头蛇毒中乙酰胆碱酯酶的含量不少于0.3%。过去认 为响尾蛇毒和蝰蛇毒不含乙酰胆碱酯酶，Tan等的发现是一种特例。除此之外，Bhat- tacharya和Gaitonde也在锯鳞蝰蛇毒中发现并部分纯化了乙酰胆碱酯酶。
(三） 不同来源乙酰胆碱酯酶的比较
早期，Mounter等（1951)和Augustinsson等（1951)指出，眼镜蛇科蛇毒中的胆碱酯 酶类似于动物组织中的乙酰胆碱酯酶。Kumar等（1973,1975)以金环蛇 蛇毒作为材料、Java等（1976)、Raba等（1979)和Kesvatera等（1979)以外里海亚 种眼镜蛇 蛇毒为材料纯化胆碱酯酶并研究了它们的性质。他们认为蛇 毒乙酰胆碱酯酶的底物专一性与高等动物红细胞中的酶十分相似，蛇毒酶分子形态则与 鱼电组织或其他高等动物组织中的酶相似。然而蛇毒酶的分子量小，它的结构显然比其他 动物组织膜上的酶简单。金环蛇和外里海亚种眼镜蛇两种蛇的蛇毒酶相比较，性质也有不 同，例如以乙酰-P-甲基胆碱作为底物时，金环蛇毒酶不表现底物抑制活性，而眼镜蛇毒酶 则明显地有底物抑制现象，说明这两种酶至少在构型方面有差别。余微明（1981)研究浙江 眼镜蛇的乙酰胆碱酯酶性质，发现该酶与一些典型的膜乙酰胆碱酯酶有不少共性。例如水 解乙酰胆碱比水解其他胆碱酯快，能被某些有机磷、氨基甲酸酯及一些所谓真性酶抑制剂 所抑制，酶活力能被高浓度底物抑制。但它是一种非膜的可溶酶，不像膜上的酶容易聚合， 与脑中的酶、鱼中的酶没有免疫交叉反应，因而可能具有它独特的结构特征，也就是说它 们之间没有共同的抗原决定簇，因而也说明抗原决定簇和酶的活性中心不在同一个部位。 抗原抗体络合后仍能进行酶显色也说明了抗原决定族和酶活性中心不在酶分子的同一部 位。
(四） 生理作用
早期有些工作者认为蛇毒中的胆碱酯酶是蛇毒毒性的主要部分，但并无实验证据。 1960年Yang等用区带电泳法从台湾眼镜蛇等几种蛇毒中分离出胆碱酯酶，观察到具有 蛇毒毒性的部分并不是胆碱酯酶的活性部分，所以他们认为蛇毒的毒性与胆碱酯酶无关。 60年代后期对蛇毒多肽毒素’的分离研究阐明了蛇毒的毒性问题，但是有些工作者仍认为 蛇毒中的胆碱酯酶对蛇毒的毒性有配合和辅助作用。近年来，前苏联科学家用CD42抑制 外里海亚种眼镜蛇毒胆碱酯酶的活力，发现蛇毒的毒性下降，在蛇毒的神经毒素I中加入 胆碱酯酶能增强蛇毒的毒性。总之，眼镜蛇科蛇毒中含有非常丰富的胆碱酯酶，但其生理 意义目前尚不明确。屈贤铭等（1兆1)对浙江眼镜蛇毒生物毒性测定的实验结果是与
Yang的工作一致的，但也有若干可供探讨的地方。在亲和层析柱流出液中还含有少量的 胆碱酯酶，是否与蛇毒的毒性有关，有待进一步研究。以纯化的胆碱酯酶腹腔注射4只小 白鼠，每只用量为500Mg，4只全部死亡，是胆碱酯酶本身的毒性，还是在此酶中尚含有其 他杂质所致呢？这种杂质是蛇毒的毒素蛋白还是其他的大分子成分呢？这些问题尚待进 —步探讨。
从眼镜蛇外里海亚种 蛇毒中发现有乙酰胆碱酯酶抑制因子，这种因子对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，其活性可以被多种阳离子可逆地抑制，0. 06mol/L的 Mg2+作用最强。已经知道这种抑制因子就是该蛇毒中的心脏毒素。它虽然能强烈抑制蛇 毒中乙酰胆碱酯酶的活性，但对哺乳动物体内的乙酰胆碱酯酶没有影响。
