(一）交换剂的选择
选择交换剂时必须考虑如下几种因素:被分离物质带何种电荷;被分离物质分子的大 小;被分离物所处的环境，尤其是环境中是否共存有其他离子，这些离子呈何种电性，数量多少;被分离物的物理化学性质，是否耐酸、碱、高温等;被分离物的大概数量;备有何种交 换剂及其性能。如果对被分离物质的性质不甚了解，那就要通过预备实验来完成交换剂的选择。
阳离子交换树脂中，以磺酸型应用最广，它在酸碱及中性溶液中均可使用，简单及复 杂的无机或有机离子都可用它进行交换。但带正电荷的胶体和高分子的阳离子则不能被 吸着或吸着很少。两性化合物如氨基酸也可用它进行交换吸着。含有苯酚的弱酸型不宜 用在碱性溶液中，尤其是在高温(80°C)时树脂易被浸毁。羧酸型的阳离子交换剂较有选择 性，可用于强碱与弱碱的分离，也可用来把碱性氨基酸与其他分开，有机碱类如链霉素也 可用它来提纯。此类交换剂对氢离子有特大的亲和力，少量的酸就可以把碱置换掉，因此 再生手续简便。阴离子交换树脂与阳离子交换树脂相似，以强碱型者应用范围广。在酸性 溶液中强碱型与弱碱型均可使用。但弱酸如碳酸、硼酸、硅酸等则不能与弱碱型产生交换 作用，必须用强碱型才能除去。在中性溶液中，以用强碱或中强碱型的交换剂为宜,碱性溶 液中则只有强碱型适用。
对于离子交换纤维素的选择，最实际的办法是用两种常用的离子交换剂分别进行试 验。通常用lml的小柱，在低盐浓度下(0. 05mol/L)用DEAE-纤维素(PH8)或用CM-纤 维素(PH6)进行试验。大多数蛋白质可被二者中的一个吸附，或二者均吸附。如果都不吸 附，可再降低盐浓度至近于零。较好是能吸附，但又吸得不太牢，以便于下一步洗脱。对于 吸得太牢、不易洗脱的物质，可改用交换当量较小的交换剂。相应的弱解离的阳离子交换 纤维素现在还没有，可用CM-纤维素在极低pH下进行层析，这样就降低了 CM-基的解 离度，从而降低其交换当量。若需要在极低或极高pH下进行层析时，如需pH在3.0以下 可用P-纤维素或SE-纤维素;pH在10以上时，可用GE-纤维素。
确定了层析所用的交换剂的类型以后，还要对交换剂的粒子大小进行选择。粒子大小 主要影响分辨率和流速。粗粒子装柱不紧密，单位体积的交换容量小，而且间隙大，容易引 起区带分散，所以分辨率低，但流速较快。细粒子分辨率高，交换容量大，缺点是流速慢。要 求高分辨率时，则采用细粒子;要求高速度，或阶段洗脱时，区带宽一些也没有多大妨害， 可用粗粒子。另外，装柱的规模也有关系，粗粒子不适于装太小的柱(直径lcm以上），细 粒子适于装小柱，直径1mm的柱也可以。
(二）离子交换剂的准备
离子交换剂的准备就是将交换剂变成适于分离各类离子的形式。准备应当包括以下 四步：
除去交换剂中的杂质:杂质是由于制作时提纯不够，即使提得很纯，在贮存时也会 有少量分解。
交换剂的溶胀:通过这一步使交换剂的带电基团更多地暴露在溶液中。
除去交换剂中的很小的细粒，否则将影响流速。
离子交换剂的平衡:将离子转变成所需要的形式，即改型。对于凝胶型的交换剂只 需要后二步，其他类型的交换剂必须经过所有这四步处理。
一般的交换剂常含有水不溶性的杂质，即使交换剂的纯度较高(如DE-52)，在贮存时 也要经受氧化降解，所以，使用前要充分洗涤。洗涤目的主要是除去杂质。对于聚苯乙烯型或苯酚型的树脂可用水、盐酸、碱、乙醇洗，最后用高浓度的平衡离子洗。一般的步骤是: 干树脂用水浸泡2h，除去水，再用无离子水洗至澄清，去水后在4倍量的2mol/L HC1中 洗4h。除去酸，用水洗至中性，去水后，再加4倍的2mol/L NaOH洗4h。除去碱，用水洗 至中性。必要时用乙醇洗。
纤维素是单糖的多聚物，其羟基被带电基团所取代。干燥时，由于没有水分子，分子内 的羟基结合在一起，结果形成浓密堆积的糖聚合物，许多功能基团被埋起来。当将纤维素 悬浮于水中时，这些少量的氢键被破坏。完全膨胀需要用更强的条件处理，即悬浮于强酸 或强碱溶液中，通常是0. 5m0l/L的HC1或NaOH。操作步骤与树脂的洗涤相同。对阳离 子交换纤维素则先用0. 5mol/L NaOH洗，然后用0. 5mol/L HC1洗;对阴离子交换纤维 素则先用HC1洗，后用NaOH洗。每次洗涤后，要用大量水洗至中性。有时这个过程要重 复几次。要除去牢固吸附在交换剂上的杂质，这一步是必须的。
除去交换剂中细粒的办法是将交换剂悬浮于大量的水中，待90%〜95%的颗粒沉降 后，倾去沉降慢的部分，否则柱的流速缓慢，分辨率也差。
最后是用适当的平衡离子平衡，也就是交换剂的改型。所谓改型，也就是使交换剂带 上所需要的离子。通常是让大量、高浓度的平衡离子溶液通过交换剂。例如，需要阳离子 交换剂带上Na+，则用NaOH溶液处理它;如需要阴离子交换剂带上Cr则用HC1溶液 处理它。改型后，过量的部分用水或稀缓冲液洗脱除去，也有用层析的起始缓冲液平衡，除 去过量部分。经过这样处理的交换剂就可以使用了。
还有一个重要的层析条件需要考虑，即层析时的pH。维持层析介质的pH，通常是用 缓冲液来实现的。对于缓冲液的选择总要考虑如下四个因素:①对阴离子交换剂应当用阳 离子缓冲液;对阳离子交换剂应用阴离子缓冲液。如果缓冲液的离子电荷与离子交换剂所 带电荷相反，那它就参加离子交换过程，并降低离子交换剂的缓冲容量，引起pH变化。② 选用的pH值决定于被分离物质的等电点、稳定性和溶解度，也要根据交换剂解离基团的 PK值。用阴离子交换剂要在低于其pK值的范围内层析;用阳离子交换剂要在高于其pK 值的范围内层析。总之，缓冲系统的pH值要这样来选择:在这个pH值，要分离的离子所 带的电荷种类与离子交换剂的平衡离子所带电荷种类相同。对于等电点在层析的pH范 围内的蛋白质，这个考虑特别重要。③缓冲液离子的PK值要在所要用的pH值附近 (士0. 7之间），这样才能有较高的缓冲能力，否则，缓冲容量低，pH可能改变，出现pH交 错界面，产生假峰。④缓冲系统的选择应不影响被分离物的活性、溶解度，不干扰其分析。 被分离物需要制成不含盐的干样品时，以用挥发性缓冲液为宜。
(三）层析柱的选择及装柱
要得到好的层析效果，必须考虑以下五个方面的问题:层析柱的高度与体积;上样量 的大小;所采用的洗脱梯度的形状和洗脱液量的多少;洗脱速度;分离物收集量的多少。
1.层析柱所用交换剂的体积，也就是装在柱中的交换剂的体积(一般叫柱床体积）， 至少要比束缚所有样品所需要的体积还要大2倍〜5倍。柱的形状一般以直径与高度之 比为1 : 15为宜，也有采用1 : 10〜1 .. 30的，总之，柱形应根据层析条件和需要而定。当洗 脱过程中梯度的变化比较剧烈时(如阶段梯度洗脱），则不能用过长的柱，否则区带扩散较 宽，降低分辨率。区带变宽的程度与柱形状有关:细长柱的分辨率显著低于直径与高度之 比较高的柱。分辨率较低的原因是，洗脱过程中存在着梯度的急剧变化。当平衡离子的浓 度高得足以置换吸附离子的时候，此离子就从柱上下来，而且它的移动速度与溶液移动速 度相同，因为这时这些离子在溶液中是自由的。如果从吸附点到收集点须走很长距离，那 么每一个吸附物质都有扩散的机会,因此形成的峰带就宽，特别是在分离静电荷很不同的 物质时更是这样，因此，如果必须增加离子交换剂的体积的话，就应增加柱的直径。
2.装柱处理好的交换剂在装入层析柱时，质量的好坏对层析效果影响很大。对装柱 的要求是，交换剂在柱中的分布要均匀，严防有“节”和气泡产生。所谓“节”是指交换剂在 柱内有明显的分界线，这是由于装柱时交换剂沉降不均匀，造成交换剂在柱内排列松紧不 一所致。气泡则是由于交换剂未被溶液完全包裹而与空气接触所引起。防止节与气泡产 生的方法是装柱内先保持一定高度的水分(一般为柱长的1/3)，加入交换剂时使交换剂 借水的浮力而慢慢沉降。如果保持交换剂面上水的高度不变(可用排泄口放水的办法来控 制），而且交换剂又是连续地缓慢沉降，“节”与气泡就不会产生。
(四）加样及洗脱
装柱完毕后，用水或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的PH值、离子强度等，即可上 样品液。样品应与起始缓冲液具有相同的pH值和离子强度。可用透析、凝胶过滤或稀释 法处理。稀释法是先将样品溶液调到所需要的pH值,然后加水稀释至与起始缓冲液具有 相同的电导度。这个方法对于洗脱液的前一部分的分辨率要求不高时可以使用。加样的 体积一般关系不大，但上柱前样品应离心除去不溶物，否则容易将柱堵住。用缓冲容量大 的离子交换剂（如羧酸型)进行的层析，有时可以免去这一步。
加样的方法是，首先排除床表面的缓冲液，再用移液管加样。加样时，移液管尖端接触 柱内壁并在离床表面数毫米处，一边加一边沿柱内壁转动一周，然后迅速移至中心，使样 品尽快分布于全表面，然后打开出口，继续加样，待样品全部进入床内后，以少量起始缓冲 液(0. 5ml〜lml)冲洗内壁数次，再加足缓冲液，开始洗脱。加样时要注意不要把床表面破 坏，否则，层析区带会不整齐。如有破坏，可搅起数毫米交换剂，使其自然沉降平整为止。
从离子交换剂上洗脱不同的离子是离子交换层析中需要控制的重要因素。洗脱液体 积(相对于柱床体积而言)的大小和洗脱梯度的形状(盐浓度的变化能力)对柱的分辨率影 响极大。洗脱可以用恒定组成的起始缓冲液来完成(简单洗脱），也可以用改变PH值或盐 浓度的方法，或二者均改变的洗脱液来完成。pH值和盐浓度的改变又分为连续改变(梯 度洗脱)和不连续改变(阶段洗脱）。
混合室B中装层析分离开始时使用的溶剂，储存器A中装洗脱液用以增加流动相的洗脱 能力，液流从B流入柱中，而洗脱液将以同样流速从A到B，所以B中液体体积不变。洗 脱液和溶剂的混合由设置的电磁搅拌装置E完成。
Cr是流出体积V后洗脱液的浓度，是储存器A中的浓度，是混合室B中开始 洗脱时洗脱液的浓度，VB是在B中液体体积。 比较高的柱。分辨率较低的原因是，洗脱过程中存在着梯度的急剧变化。当平衡离子的浓 度高得足以置换吸附离子的时候，此离子就从柱上下来，而且它的移动速度与溶液移动速 度相同，因为这时这些离子在溶液中是自由的。如果从吸附点到收集点须走很长距离，那 么每一个吸附物质都有扩散的机会，因此形成的峰带就宽，特别是在分离静电荷很不同的 物质时更是这样，因此，如果必须增加离子交换剂的体积的话，就应增加柱的直径。
2.装柱处理好的交换剂在装入层析柱时，质量的好坏对层析效果影响很大。对装柱 的要求是，交换剂在柱中的分布要均勻，严防有“节”和气泡产生。所谓“节”是指交换剂在 柱内有明显的分界线，这是由于装柱时交换剂沉降不均匀，造成交换剂在柱内排列松紧不 一所致。气泡则是由于交换剂未被溶液完全包裹而与空气接触所引起。防止节与气泡产 生的方法是装柱内先保持一定高度的水分(一般为柱长的1/3)，加入交换剂时使交换剂 借水的浮力而慢慢沉降。如果保持交换剂面上水的高度不变(可用排泄口放水的办法来控 制），而且交换剂又是连续地缓慢沉降，“节”与气泡就不会产生。
