一丶原 理
亲和层析是一种具有专一性的、高效能的提纯分离生物分子的层析方法。生物体中大 分子化合物具有能与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性,如抗原-抗体、激素-受 体、酶-底物或抑制剂等，这种结合往往具有专一性和可逆性。生物分子间的这种结合能力 称为亲和力。设法把某一对具有结合亲合力的物质中的一种物质吸附或结合在凝胶上作 固定相，称为配基，另一种物质为流动相，即样品。当混有其他杂质的样品通过含有配基的 凝胶时，样品物质即与其配基结合而滞留，其他杂质则被洗涤流去,然后改变洗脱液的条 件如pH，使样品物质再分离被洗脱流出而得到分离纯化。
亲和层析中最常用的生物体系如下：
酶:底物类似物、抑制剂、辅酶。
抗体:抗原、病毒、细胞。
外源凝集素:多糖、糖蛋白、细胞表面受体、细胞。
核酸:互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合蛋白。
激素及维生素:受体、载体蛋白。
细胞:细胞表面特异蛋白、外源凝集素。
亲和层析的优点是在温和条件下操作简单，效率高，特别对分离含量极少而又不稳定 的活性物质最有效，甚至从粗抽提液中经亲和层析一步就能提纯几百至几千倍。例如分离 胰岛素受体时，把胰岛素作为配基，偶联于琼脂糖载体上，经亲和层析，使肝细胞抽提液中 的胰岛素受体纯化达8 000倍。
亲和层析的局限性在于不是任何生物高分子物质都有特定的配基，针对某一分离对 象就需要制备专一的配基和选择特定的层析条件。
由于琼脂糖这一理想载体的出现以及固定化技术的改进，使亲和层析技术得到越来 越广泛的应用，发展十分迅速，目前已有几百成功的例子，也有了作为亲和层析载体的商 品供应。因此，亲和层析技术已成为生物化学中分离提纯生物活性物质的重要方法之一。
二、载体的选择
亲和层析的成功首先在于载体的选择。理想的载体应该具备以下几个特性：
具有不溶性，这是载体的起码条件。
具有高度有效的稀松的多孔网状结构，能使大分子自由通过，从而增加配基的有效浓度。
良好的机械性能与适当的颗粒性，有良好的流动特性。
非特异性吸附应尽可能小,为惰性载体。
具有大量能被活化的化学基团。
有较好的物理和化学稳定性，能经得起配基固定化和亲和层析时可能采用的各种 条件(如PH、离子强度、温度、变性剂、去污剂等）。
能抵抗微生物与酶的破坏。
具有高度亲水的特性。
这里有几点需要作一说明:首先，大分子化合物结合程度是有效配基浓度的函数，在 配基与大分子之间的亲和力低时更是如此，因此在温和条件下载体必须具备许多可供配 基结合的部位。这些部位一旦被配基取代以后，也要很容易被大分子化合物接近，因此载 体还必须具备多孔结构。只有在下面两种情况下，多孔结构不是决定性的因素: 第一种情 况是当欲纯化的大分子与配基之间的层析亲和力非常高时，此时载体表面有限数量的结 合部位足以将全部大分子化合物结合。 第二种情况是层析结合的化合物的分子太大，甚至 不能进入网眼非常大的载体内，例如分离多聚核蛋白体、膜片段、细胞器以及完整细胞等 情况下即是如此。其次，目前可作为生物亲和层析的载体的有：纤维素、SMDA- Sepharose、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、聚苯乙烯、交联共聚与物理包埋以及多孔玻璃 等，而当前常用的载体只有琼脂糖、聚丙烯酰胺、葡聚糖与多孔玻璃，其中又以琼脂糖最为 常用。因此，下面的叙述，重点介绍琼脂糖，其他只是一般提及。
(一）纤维素及其衍生物
纤维素是制备固相酶与免疫吸附剂的常用载体，也是亲和层析最早使用的载体。纤维 素有价廉及来源充足的优点，也有操作方便的优点，但由于它的纤维性和不均一的缺点， 蛋白质大分子难以渗入，而且非专一的吸附作用也较为严重，因而由纤维素制备的吸附剂 进行亲和层析往往提纯倍数不高，活力回收也不够理想。由于小分子配基的衍生物比大分 子配基更容易受到纤维素的空间干扰，因而小分子的纤维素衍生物的分离效果也不如大分子配基的衍生物好。
(二） S-MDA 树脂
淀粉用过碘酸盐氧化产生淀粉二醛，再用4,4-Diaminodiphenylmethane缩合，最后 进行Schiff，s碱还原，形成S-MDA树脂。
(三） 葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是由多聚葡萄糖环氧氯丙烷交联而成的产物。已有珠状的凝胶出售，商品 名为Sephadex。它有良好的化学及物理稳定性，但多孔性较琼脂糖凝胶为低，并且经过偶 联配基的操作后，凝胶的膨胀度将进一步缩减，因而在亲和层析中的应用也受到一定限制。
(四） 乙烯与顺丁烯二酸酐(MEA)的共聚物
乙烯与顺丁烯二酸酐(MEA)的共聚物在国外已有商品生产。将酶(Trypsm chy- motrypapain subfilopeptidase A.B)结合到这种共聚物上后，商品名为Enyite-EMA，这种 制品含酶量高达60%。
Gdldstein等对酶结合到EMA载体上的特性进行了研究，Friy等则利用水解酶研究 抑制剂，又利用抑制剂研究水解酶。
(五） 聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶的物理化学性质十分稳定，抗微生物侵蚀的能力比琼脂糖强，有更多 的可供化学反应的酰胺基，提高了配基的浓度，故特别适用于配基和亲和物之间亲和力比 较弱的系统。用Biogel制得配基高度取代的衍生物，就能增强物质间的相互作用而成功 地进行亲和层析。以聚丙烯酰胺凝胶为载体可制得各种衍生物。
叠氮衍生物通过聚丙烯酰胺的酰基经水合肼处理后形成酰肼基，再由亚硝酸处 理而成叠氮基衍生物。它可以和具有脂族或芳香族氨基的配基偶合。
氨基衍生物带有酰胺基的聚丙烯酰胺衍生物可与脂族二胺反应制得氨基衍生 物。它可以和带羧基的配基偶合。利用脂族二胺中的烃长度可以控制“手臂”的长短。
酪氨酰衍生物聚丙烯酰胺叠氮衍生物进一步和甘氨酰酪氨酸反应可制得酪氨 酰衍生物，它可以和带有氨基的配基经重氮化合相偶联。
(六） 多孔玻璃及其衍生物
在固相酶中出现的多孔玻璃也已被应用于亲和层析作为载体，烷基胺取代的多孔玻 璃商品名为Bio-Glass，多孔玻璃的优点在于不受微生物的侵蚀，经得起有机溶剂与缓冲 液组成的改变。但是，玻璃表面对蛋白质也具有非专一吸附，而且所制得的吸附剂只依靠 表面作用，因而它的广泛应用还有待更多的研究。
(七） 琼脂糖及其衍生物
琼脂糖是D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相间结合的链状多糖，琼脂糖已制成珠状凝胶颗粒，商品名瑞典称为Sepharose(Pharmacia)，美国称Bio-gel A,中国称琼脂糖凝胶(Agarose gels)。琼脂糖凝胶为珠状凝胶，是固体膨胀状态,混悬于 水中含有0. 02%的叠氮钠作为防腐剂，有如下3种型号:Sephar0se 6B，含有6%的琼脂 糖浓度，颗粒大小为40Mm〜210ftm，分离范围105〜106分子量;Sepharose 4B，含有4%的 琼脂糖浓度，颗粒大小为40/nm〜190)um，分离范围为3X105〜3X106分子量;Sepharose 2B，含有2%的琼脂糖浓度，颗粒大小为60fxm〜250/xm，分离范围为2X106〜25X106。最 常用者为Sepharose 4B。
