一、高压液相色谱的特点
高压液相色谱也叫高效液相色谱，由经典的液体柱层析引入气相色谱理论，并且对相 体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和电子 计算机等，在60年代末发展成为现代液相色谱——高压液相色谱。高压液相色谱 (HPLC)具有以下特点：
1.高压供液压力和进样压力都很高，一般是I5. 2MPa〜35. 4<5MPa以上。
2.高速载液在色谱柱内的流速比经典液相色谱高得多，可达Iml/min〜15ml/min。
3.高效由于采用了新型的固定相，提高了分离效率。
高灵敏度采用了基于光学原理具有高灵敏度的检测器，例如紫外吸收检测器、 示差折光检测器、荧光检测器等。紫外吸收检测器灵敏度可达到l0_9g/ml〜KT^g/ml数 量级。
梯度洗脱洗脱液的组成可以是连续变化的，增加了洗脱强度，缩短了分析时间。
二、高压液相色谱的分类
高压液相色谱根据分离机制的不同可分为四种类型:离子交换色谱、吸附色谱、空间 排斥色谱(或凝胶渗透色谱)、分配色谱。
离子交换色谱利用离子交换树脂上的可电离的离子与流动相中具有相同电荷 的溶质离子进行可逆交换，由于这些离子在交换剂上亲和力不相同而被分离。
M++Na+ —-CXS-树脂一M+—(XS —树脂+Na+
(溶液） （溶液）
x-+cr—扣一树脂一x-—町―树脂+cr
(溶液）
M+:阳离子 X、阴离子
固定相常用两种离子交换树脂:多孔性树脂和薄壳型树脂。多孔性树脂是球型的纯离 子交换树脂，薄壳型树脂是在玻璃球上涂敷薄层离子交换树脂。
凡是在溶剂中能够离解的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离，它广泛用 于分析氨基酸、药物、代谢物、无机盐和一般含离子的化合物。
流动相通常是含有少量水的有机混合溶剂，对相近的不同混合物的流动相，经常采用 梯度洗脱来分离。
吸附色谱根据吸附作用的不同来达到物质的分离。当样品分子与溶剂分子在固 定相表面竞争吸附时，官能团极性强度大而且数目多的样品分子有较大的保留值。反之保R' =ns/nm (1)
其中〜为溶质在固定相中的克分子数，〃m为溶质在流动相中的克分子数。在实际应 用中，为了计算，值，需要把上式经推算而得到下等式
式中从为某一溶质的滞留时间，为不保留溶质在色谱柱中的滞留时间。由此式可 以看出，通过色谱柱所需时间长的化合物容量比较大。
(二）色谱柱的选择性
色谱柱的选择性指的是色谱柱对两种不同的化合物产生不同滞留时间的能力。可以 根据下式计算色谱柱的选择性因子分别为化合物1及化合物2的滞留时间，应当说明的是在色谱分析过 程中一般都有两种以上的化合物，这时可以用相距最近的两个化合物的选择性作代表。倘 若只对其中某些化合物感兴趣，也可以根据这些化合物来确定该色谱条件下的选择性。
(三）色谱柱的效率
所谓色谱柱的效率，是指分析过程中色谱柱保持溶质分子不扩散，得到较窄的色谱峰 的能力。柱效率可用理论塔板数〜来定量地表示。
溶质的洗脱峰相应的滞留时间，W为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。在 相同的洗脱条件下，滞留时间长的洗脱峰宽度也增加。换句话说，在一色谱柱中用相同的 洗脱条件时，不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近于常数，因此理论塔板数是 色谱柱的特征参数，理论塔板数大的色谱柱效率高，用理论塔板数大的色谱柱能得到较窄 的洗脱峰。然而理论塔板数的大小与柱长有密切关系，较长的色谱柱理论塔板数亦较高。 为了便于不同色谱柱的比较，还需要一个不依赖柱长的量，这就是理论塔板高度H。
L为柱长。用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H数值越小则色谱柱的效率越 高。由于色谱柱中区带增宽是由纵向扩散、涡流扩散及质量转移等因素产生，因此色谱柱 的理论塔板高度也是由这三种因素产生，即：
式中办为载体颗粒直径，Dm及AS为溶质分子在流动相及固定相中的扩散系数，D 为固定相厚度，V为流速。
式中 第一项由涡流扩散产生，第二项由纵向扩散产生， 第三及第四两项则是由质量转 移产生。该式表明柱效率受到多种因素的影响。下面还将对该式做一步讨论。
(四）色谱分析的分辨率及其控制的一般原则
色谱柱的分辨率无疑是任何一个色谱工作者最为关心的问题，不断提高分辨率则是 他们的主要目标。而要想提高分辨率还必须知道分辨率与色谱分析中其他有关参数间的 相互关系。这种关系在以下公式中得到了清楚的表达：
这是分辨率控制中一个关键的公式，它说明色谱柱的分辨率与色谱柱的效率、溶质在 该色谱条件下的容量比以及色谱柱对溶质的选择性有密切的关系。下面将根据该公式逐 项讨论提高色谱分析的分辨率的一般原则。
1.分辨率尺S与柱效率7V分辨率公式(8)表明色谱柱的分辨率与柱效率的平方根 成正比，提高柱效率是提高分辨率的最直接也是最有效的手段。由于较长的色谱柱具有较 大的理论塔板数iV，在需要提高分辨率的时候，人们往往想到的一个途径是增加柱长。柱 长增加1倍可以使分辨率提高约40%。然而柱长增加1倍，色谱柱两端的压力也增加1 倍，而且溶质的稀释程度也将大大增加。这就说明用增加柱长来提高分辨率，远不是人们 所希望的理想的方法。
从式(6)可以知道，色谱柱中载体颗粒直径的大小对色谱柱的效率有着极为重要的影 响，降低载体颗粒直径不仅影响到式(6)中的 第一项与 第四项，即涡流扩散及流动相质量 转移所产生的H，对于多孔载体来说，还会由于固定相厚度的减小而影响固定相质量转 移产生的H。因此使用直径较小的载体必将大大提高理论塔板数= ，从而得 到较高的分辨率。多年来人们的实践也证明，使用颗粒直径较小的载体是提高色谱柱分辨 率的一个十分有效的办法。使高效液相色谱与经典色谱法区别开来的一个重要的特点，正 是在于它使用了较经典色谱法小得多的载体。高效液相色谱法中，常用载体的直径为 10/nm和5/xm，更小的载体，即直径为3jnm的载体也许在不久的将来会在市场上出 现。
色谱柱选定以后，影响色谱效率的另一个重要因素就是流速。微粒多孔载体的色谱柱 有一个较好流速，在该流速时可以得到最小H值，亦即较大柱效率。这时，若流速增加，由 于溶质在固定相和流动相之间不能很好地平衡而使H值上升，柱效率下降;而流速下降 则会由于溶质的纵向扩散而降低柱效率。不过在一般情况下色谱分析中所使用的流速 (0.5ml/min〜2ml/min)总是大于该最适流速，因而可以通过降低流速而提高柱效率，无 需考虑较好流速。
提高柱效率的目的还可以通过增加溶质的扩散系数来实现。一种溶质在溶剂中的扩 散系数除了与溶质本身的分子大小和性质有关外，与溶剂的粘度也有着密切的关系。溶剂 的粘度越大，溶质的扩散系数就越小，用粘度大的溶剂做流动相时柱效率随之而降低，因 此在色谱中总是尽可能选择粘度较小的溶剂，有时还在较高的温度下进行色谱分析，以降 低流动相的粘度,提高柱效率。
2.分辨率沁与溶量比，分辨率与成正比，因此当，为0时，亦 即溶质在固定相中的克分子数为0时分辨率为0,这意味着不能进入静止相的溶质在色 谱柱中得不到分离。尺'增加后分辨率也随之增加。在高效液相色谱中一般将^控制在2 〜5之间。当R'超过5时，R'的增加将使色谱间大大延长而分辨率提高有限，这一现象
从表3-13-7可以清楚地看到。一种溶质在高效液相色谱中的 容量比受到流动相溶剂的强度的控制。所谓溶剂的强度指的是溶剂在色谱柱中洗脱溶质的能力的大小。凡洗脱能力强的溶剂就是强溶剂，洗脱能力弱的是弱溶剂。无论是强溶剂还是弱溶剂的性质都不是一成 不变的。性质不同的载体对强溶剂
的物理化学性质的要求也不同。例如正常相色谱法中亲水性强的溶剂为强溶剂，在反相色 谱中疏水性强的溶剂为强溶剂，而在离子交换色谱中以离子强度大的溶剂为强溶剂。
在整个色谱过程中如果只用一种溶剂洗脱，在洗脱过程中溶剂的强度不变，这种洗脱 方式通常称为等强度洗脱。这种洗脱方式的较大优点是操作简单。但在分析比较复杂的 样品时如只用一种溶剂不能得到满意的分离效果，就应考虑用梯度洗脱。所谓梯度洗脱就 是在洗脱过程中分步地或者连续地改变流动相的组成，使其溶剂强度由弱到强逐渐增加。 分步地或连续地改变流动相的洗脱过程分别称为分步梯度洗脱，或连续梯度洗脱。至于用 什么样的梯度洗脱最为合适，只有通过试验才能知道。
3.分辨率与选择性因子《增加选择性因子《显然可以增加色谱分析的分辨率。 然而问题在于〃的变化不像柱效率W以及容量比^那样有规律可循。不同因素对《影 响难以预测，特别是在样品中含有多种化合物时，其中一部分化合物的选择性因子增加往 往伴随着另一些化合物选择性因子下降。因此常常需要经过多次试验才能得到较为满意 的选择性。这里只能列出几个可能影响选择性因子的主要因素，供色谱实验时考虑。
改变流动相的溶剂:在希望增加色谱的选择性因子时，首先考虑的途径是用不同 类型的溶剂作为流动相。由于不同的溶剂与溶质间相互作用的特点不一样，它们能使溶质 的色谱行为发生变化，因而有可能通过选择不同类型的溶剂改进选择性特性。
改变流动相的pH值:这一手段只适用于可电离化合物的色谱分析。不同的化合 物以及不同化合物产生的影响也不一样。由于一种化合物带电荷的多少能影响其溶解特 性，或是它与固定相结合的强度，从而进一步改变它在色谱柱中的滞留行为，因此pH的 变化对可电离化合物色谱分析的选择性影响是较大的。
改变固定相:不同的固定相与被分离化合物之间的相互作用的性质、特点以及强 弱各不相同。例如吸附色谱法分离几何异构体的效果较好，反相色谱法主要根据化合物 疏水基团的特性进行分离，离子交换色谱法恰恰相反，适于分离带有不同的电荷的化合 物。因此应当根据要分离化合物的特点来选择合适的固定相。
