聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用被分离物质所带电荷多少、分子大小、形状等的不同，在 电场的作用下各种被分离物产生的移动速度也不同的性质，使被分离物得到分离。这种 方法具有电泳和分子筛的双重作用，并有下列优点：①凝胶孔径大小可以通过单体的浓 度或单体和交联剂的比例进行调节；②凝胶的机械强度好，弹性大，对热稳定，无电渗 作用；③凝胶无色透明，易于观察；④聚丙烯酰胺凝胶电泳设备简单，所需样品量小 (lug〜100Mg)而分辨率高；⑤用途广泛，对蛋白质、酶、多肽、核酸等都能进行分离鉴 定。
(一）聚丙烯酰胺凝胶的聚合
丙烯酰胺（单体）和N，N'-甲撑双丙烯酰胺（交联剂）在催化剂的作用下，聚合 成含有酰胺基侧链的脂肪簇长链，相邻的两个链再通过甲撑桥交联起来形成具有三维网 状结构的聚丙烯酰胺凝胶。
聚合反应中常用的催化剂(包括催化剂和加速剂)有下列两种：
过硫酸铵-TEMFD(四甲基正乙二胺)系统当Acr和Bis的溶液中加入这种催化 系统后，过硫酸铵[(NH4)2S208]产生自由基氧原子(S20l_—2SO_4)与丙烯酰胺接触，使丙 烯酰胺活化，从而发生聚合作用。聚合的初速度和过硫酸铵浓度的平方根成正比。这种催 化系统需要在碱性条件下进行，例如在PH8. 8条件下，7%的丙烯酰胺溶液30min就能聚 合完毕，但在PH4. 3时聚合很慢。温度与聚合的速度成正比。如温度过低，溶液体系内有 氧分子或不纯物质存在都要延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子而妨碍聚 合，在聚合前必须将溶液分别抽气，然后再混合配制。
核黄素-TEMED系统是一个光激发的催化反应。核黄素在光照下分解，黄素被 还原成无色型，在有氧条件下无色型又被氧化成有自由基的黄素环，使丙烯酰胺活化，从而发生聚合作用。该系统作为催化剂的优点是:①核黄素用量少(lmg/100ml)，对所分析 样品没有任何影响。②聚合作用所需的时间可以自由控制。变化光照的时间、强度，可使 聚合延缓或加速。凝胶的机械强度和弹性是很重要的，它与凝胶总浓度和Acr与Bis两者 之比有关。
其中是很关键的，一般应控制在a : 6 = 30左右。如a : 6<10,凝胶变脆、硬，呈乳白色。a: b>100 时，:T=5%的凝胶呈糊状，也易断裂。T为2%〜5%时，a : b=20左右;T为5%〜10% 时，a : 6=40左右;r为15%〜20%时，a : 6=125〜200。为此，Richard等提出便于选择 T和C的经验式:C=6. 5 — 0. 3T。研究大分子核酸作用的凝胶多为:T = 2. 4%，因太软不 易操作，常加入0. 5%琼脂糖以增加机械性。
(二）聚丙烯酰胺凝胶的孔径
凝胶内网孔的大小和凝胶浓度及交联度有关。若不是卷曲的分 子应为Snm;々为常数，取决于凝胶的几何构型，若多聚体的链是以近直角交联，则为1.5 左右。
T值增大，孔径相应变小。值得注意的是当r值不变时，Bis浓度在5%时孔径最小， 高于或低于5%时，孔径相应变大(表3-13-9)。常用的所谓标准胶是指T为7. 5%，大多 数生物体内的蛋白质在此胶中电泳都能得到满意的结果。分析不同分子量的物质时，凝胶 T的选择见表3-13-10。
表3-13-9 Bis浓度对平均孔径的影响
|
丙烯酰胺 总浓度T(%) |
|
半 径 |
(nm) * |
|
|
|
5% |
15% |
25% |
|
|
6. 5 |
24 |
19 |
2.8 |
/ |
|
8.0 |
23 |
16 |
2.4 |
36 |
|
10.0 |
19 |
14 |
2.0 |
30 |
|
12.0 |
17 |
9 |
/ |
/ |
|
15.0 |
14 |
7 |
/ |
/ |
(三） 缓冲系统的选择
在选择缓冲系统时，主要应从以下两方面考虑：
pH范围和离子强度对蛋白质来说，选择的pH值应使样品中各种蛋白质分子迁 移率的差别较大。酸性蛋白质在高PH条件下，碱性蛋白质在低pH条件下电泳，分离效果 更好。目前，常用的分离胶缓冲系统有三大类:高PH(PH9左右）、低PH(pH4左右)和中 性。离子强度一般选择在0. 0lmol/L〜0. lmol/L之间。以离子强度较低为佳，因为离子强 度低，电导就低，电导低的优点是能产生高电压梯度，使得电泳分离过程短，产热也小，分 离效果好。
连续和不连续系统连续系统是指电泳槽内缓 冲液和pH与凝胶中的缓冲液和pH相同。不连续系统 是指电泳槽内的缓冲液系统和pH与凝胶中的缓冲液 系统和pH不同。前者操作虽然比较麻烦，但分辨率明 显高于后者。
(四） 不连续盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳
不连续盘状电泳往往包含两种以上的缓冲液pH 值和凝胶孔径，如图3-13-10所示。图中①为样品胶 (其中含有样品）,②为浓缩胶(又名成层胶），这两种胶 的缓冲液、pH值和孔径大小完全一样。③是分离胶 (又名电泳胶），其孔径一般比浓缩胶小，PH也不同。
样品胶和浓缩胶是了 = 3%、(：=20%的单体溶液在 Tris-HCl缓冲液中，由核黄素催化合成的的大孔胶， pH为6. 7。而分离胶是由r = 7%、C = 2. 5%的单体溶 液，在Tris-HCl缓冲液(pH8. 9)中，通过过硫酸铵催 化聚合成小孔胶。电泳槽内的缓冲液是Tris-甘氨酸缓 冲液(pH8. 3)。由于凝胶的孔径和缓冲液的pH不同而产生浓缩效应、电荷效应和分子筛 效应，使电泳的灵敏度、分辨率提高。
1.浓缩效应样品通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层，一般能浓缩几百倍。机制是样品胶和浓缩胶的Tris-HCl缓冲液pH为6. 7，电泳时，由于HC1的解离大，几乎全部释 放出CP，而电泳槽中的Tris-甘氨酸缓冲液pH为8. 3，甘氨酸的等电点为6. 0，在电泳中只 有极少数分子(0. 1%〜1%)解离成H2N—CH2-COCr。一般蛋白质在此pH值下也解离 为带负电荷的离子，其解离度比HC1小，比甘氨酸大。
m为泳动率为解离度;为有效泳动率。根据有效泳动率的大小，cr泳动最快， 称为快离子(或称先行离子）;H2N—ch2+coct泳动最慢，称为慢离子(或称随后离子）。 凝胶中都含有快离子，电泳槽中的缓冲液含慢离子。电泳开始后，由于快离子的泳动率最 大，在快离子后边就形成一个离子浓度低的区域，即为低电导区，可产生较高的电势梯度。 因电导与电势梯度是成反比关系电势梯度电流强度;7:电导率]， 这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动，因而在高电势梯度和低电势 梯度之间形成一个迅速移动的界面(图3-13-11)。由于样品中蛋白质的有效泳动率恰好介 于快、慢离子之间，所以也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩成一狭小的样品薄层。
电荷效应混合蛋白质样品被 浓缩成薄层，进入分离胶。由于各种蛋 白质的等电点不同，在同一 pH的缓 冲液中，所带的电荷量不同，经过一定 时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序 排列成一个一个圆盘状的蛋白质区 带。
分子筛效应由于分离胶的孔 径一致，分子量或构型不同的蛋白质 通过分离胶所受摩擦力不同，受阻滞 的程度也不同，而表现出不同的泳动 率，即称为分子筛效应。
(五）操作方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳按其装置不 同可分为三类:①用于分析的垂直管 型盘状电泳;②用于分析和制备的垂 直板型电泳;③用于制备的垂直柱型盘状电泳。这三种形式的凝胶电泳操作方式基本相 同，不同的只是用于凝胶的支架或为玻管，或为玻璃板，或为装有循环水浴套的柱。这里以 最常用、最简易的垂直管型盘状电泳为例，说明凝胶电泳的操作过程。
1.垂直管型盘状电泳的设备电泳仪的电源一般采用电泳仪的直流稳压电源，要求 每凝胶管电流强度达5mA。电泳槽上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。上、下槽 的缓冲液中分别有正、负电极通入。在必要时下槽外壳可通入冷水促使降温，上槽底部有 很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。
2.凝胶的制备前面已经提到，凝胶浓度及交联剂浓度决定了凝胶网孔直径，而不连 续的缓冲系统和pH又会影响样品压缩成层的效果，这两项因素决定了凝胶电泳的分辨率，因此凝胶的配制必须符合这两项要求。下面介绍适于一般蛋白质样品用的凝胶系统的 配制：
(1)溶液的配制：先按表3-13-11配制8种溶液，配好后于4°C下避光保存。表中 TEMED是聚合加速剂，即N，N，N'，N'-四甲基乙二胺，Bis是交联剂，即N,N'-甲撑双 丙烯酰胺。
|
表3-13-11贮液及工作溶液的配制 |
|||
|
|
贮液* 100ml溶液中的含量 pH |
工作溶液混合比 |
|
|
1 |
lmol/L盐酸 |
48. 0ml |
小孔凝胶(分离胶） |
|
|
Tris |
36. 6ml |
1份1号 |
|
|
TEMED |
0. 23ml 8. 9 28. Og |
2份2号 |
|
2 |
Acr |
1份水 |
|
|
|
Bis |
0. 735g |
4份3号 |
|
3 |
过硫酸铵 |
0.14g |
PH8.9,凝胶浓度7% |
|
4 |
lmol/L盐酸 |
约 48ml |
大孔凝胶 |
|
|
Tris |
5. 98g |
(浓缩胶、样品胶） |
|
|
TEMED |
0. 46ml |
1份4号 2份5号 |
|
5 |
Acr |
10. Og 6. 7 |
1份6号 |
|
|
Bis |
2. 5g |
4份7号 |
|
6 |
核黄素 |
4. Omg |
pH6. 7 |
|
7 |
蔗糖 |
40. Og |
凝胶浓度2. 5% |
|
电极缓冲液 Tris 甘氨酸 加水到1L |
6. Og 8.3 28. 8g |
用时稀释10倍 500ml可供走12个 管 |
|
凝胶的制备:分离用胶的制备按下式：1号：2号：水：3号=1: 2 : 1 : 4(体积 比）配方充分混合，置于干燥器内抽出其中的氧气，用微量注射器注入玻管至6cm高，胶 面轻轻地加入蒸懷水层(0. 5c.m高）。聚合在30min〜60min内完成(聚合速度与液体温度 有关），聚合后吸去水层。
浓缩用胶的制备按下式:4号：5号：6号：7号=1 : 2 : 1 : 4(体积比)配方配制。样 品液中应含20)ug蛋白（如用粗蛋白则应为200ug）。混匀抽气，用微量注射器加至浓缩用 胶的胶面上，日光灯下聚合20min。
电极缓冲液的选择：电极缓冲液应根据被分离成分的性质而定。一种为阴离子电 泳系统(PH9.0)，上槽接负极，下槽接正极，可采用溴酚蓝作示踪染料，蛋白质在pH9.0 时带负电，向正极移动。另一种为阳离子电泳系统(PH4.0)，上槽接正极，下槽接负极，可 用亚甲基绿作示踪染料，适用于碱性蛋白，在此pH下，碱性蛋白带正电，向负极移动。
电泳:加样完毕，先在玻管中以缓冲液注满，再加入足量的电极缓冲液，开始通电， 当指示色带未进入凝胶前，保持电流2. 5mA/管，色带进入胶面后，电流增大至3mA/管， 调节电压以稳定电流。当示踪染料接近管的底端时，停止电泳。一般约需2h。
染色:停止电泳后，取出玻管，以注射器盛水，将针尖插入胶和壁管之间，一边旋 转，一边不断压水，凝胶即落出。含丙烯酰胺量在15%以上的凝胶可用10%甘油水溶液代 替水注入管壁。胶取出以后，浸于含0. 5%氨基黑10B的7%醋酸中染色lh。
电解胶色:取出染色的胶，用水冲去多余染料，再进行电解脱色。即在一玻璃槽中 盛7%醋酸溶液，已染色胶置于槽中间，两边加直流电压30V〜40V,电流0. 5A左右，lh 〜2h即可脱色完毕。
