(一）原理
1968年以来，Margolis和Slater等人先后采用了凝胶浓度梯度电泳或称孔径梯度电 泳，作为分离和鉴定蛋白质的方法，并首次将此方法用于分子量的测定。这个方法不同于 盘状电泳，盘状电泳是在均一浓度的聚丙烯酰胺凝胶中进行的电泳。后来R0db0rd等人 比较了线性梯度和非线性梯度电泳以及在均一胶浓度中的电泳，证明梯度凝胶电泳分辨 率更好。
在线性梯度凝胶电泳中，蛋白质在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐减小 的方向迁移，随着电泳的继续进行，蛋白质受到孔径的阻力愈来愈大。起初，蛋白质在凝胶中的 迁移速度主要受两个因素的影响:一是蛋白质本身的电荷密度，电荷密度越高，迁移速度愈快; 二是蛋白质本身的大小，分子量愈大，迁移速度愈慢。当蛋白质迁移所受到的阻力大到足以完 全停止它前进时，低电荷浓度的蛋白质将“赶上”与它大小相似，但具有较高电荷密度的蛋白 质。因此，在梯度凝胶电泳中，蛋白质的最终迁移位置仅取决于它本身分子的大小，而与蛋白质 本身的电荷密度无关。梯度凝胶电泳的情况可用图3_13-12来表示。
图中的方格代表凝胶的孔径，自上而下孔径逐渐变小，形成梯度。图中圆球分别代表 大、中、小三种不同的蛋白质分子。A代表电泳开始前分子的分布状况，B代表经过长时间 电泳后的分布状况。所有大小不同的分子进入凝胶孔径梯度中，大、小分子分别滞留于与 其分子大小相当的凝胶孔径中，不再向前移动，因而得到分离，形成三个区带。从以上讨论 看出，在梯度凝胶电泳中，分子筛效应体现得更为突出。由于蛋白质的相对迁移率与其分 子量的对数在一定范围内成线性关系，因此通过制作标准曲线，在相同条件进行未知样品 的电泳，便可测定出未知蛋白质的分子量。
(二） 特点
梯度凝胶电泳与均一凝胶电泳相比有如下的优点：
具有使样品中各个组分浓缩的作用。在样品太稀的情况下，可在电泳过程中分二、 三次加样，由于大小不同的分子最终都滞留于与其相应的凝胶孔径中而得到分离。
可提供更清晰的蛋白质谱带，因此能用于鉴定蛋白质的纯度。
可以在一个凝胶片上同时测定分子量范围相差相当大的蛋白质。例如:胶浓度为 4%〜30%梯度胶可以分辨的分子量范围为50 000〜2 000 000。
可以直接测定天然状态蛋白质的分子量，不需解离为M基。这一方法可与SDS凝 胶电泳测定分子量的方法相互补充。
梯度凝胶电泳主要适宜于测定球蛋白的分子量，而对纤维蛋白将会产生较大的误差。 再者，由于分子量的测定仅仅是在未知蛋白质和标准蛋白质到达了被限定的凝胶孔径时 (即完全被阻止迁移时）才成立，在电泳时要求足够高的伏特小时（一般情况下不低于 2 OOOVh)，否则将得不到预期的效果。因此，采用这一方法测定蛋白质的分子量有一定局 限性。
(三） 操作方法
1.试剂的配制①贮液④:称取10. 75g Tris、5. 04g硼酸、0. 93g EDTA(EDTA-2Na .2H20)，溶于蒸馏水中，检查pH为8. 3后，定容至1 000ml。②贮液®:称取57. 6g丙 烯酰胺和2. 4g甲撑双丙烯酰胺，溶于贮液®中,定容至100ml，然后过滤。③贮液©:称
取7. 68g丙烯酰胺、0.32g甲撑双丙烯酰胺，溶于贮液®中,定容至l00ml。④贮液④:取 0. 3ml四甲基乙二胺(TEMED),溶于贮液®中，定容至100ml。⑤贮液©:称取0. 3g过 硫酸铵，溶于贮液®中，定溶至100ml，临用前配制。⑥电极缓冲液[0. 09mol/LTris- 0. 08mol/L 硼酸-0.0025mol/L EDTA(pH 8.4)]:称取 10.98g Tris、4.95g 硼酸、0.938£0- 丁八咖丁八-21^.2托0)，力[|7欠溶解，定容至1001111。(2)25%乙醇。_.1%溴酚蓝指示剂。 ⑨固定液:10%的磺酸水杨酸溶液。⑩染色液(0.1%考马斯亮蓝R250-25%甲醇-10%乙 酸溶液）:称取lg考马斯亮蓝R250,溶于250ml甲醇，再加入100ml冰乙酸，用水定容至 1 000ml。⑪脱色液（25%甲醇-10%乙酸）：取250ml甲醇、100ml冰乙酸加水定容至 1 000m丨。⑫7%乙酸。⑬标准蛋白质:瑞典Pharmacia公司出品（见表3-13-13)。
表3-13-13 5种标准蛋白质
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蛋白质名称 |
分子量 |
来 |
源 |
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甲状腺球蛋白 ， |
669 000 |
猪甲状腺 |
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铁蛋白 |
440 000 |
马 |
肺 |
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过氧化氢酶 |
232 000 |
牛 |
肝 |
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乳酸脱氢酶 |
140 000 |
牛 |
心 |
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血清清蛋白 |
67 000 |
牛血清 |
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仪器的准备①电泳槽:本实验所用的电泳槽为垂直板型电泳槽。使用前装好，试 漏。②梯度混合器:本实验所用的梯度混合器容积小，其直径为1. 8cm，高5. 3cm，较大容 量为15ml。③用直径1. 5mm〜2. 0mm的聚乙烯管将梯度混合器、蠕动泵、凝胶膜相连。
4%〜30%梯度胶的制备预先准备好配胶的全部贮液，计算出凝胶膜所需的体 积。
4%胶液的配制：贮液© :贮液④：贮液④=2 : 1 : 1(体积比），取3. 5ml贮液 ©，加1. 75ml贮液@，混合后抽气，再取1. 75ml贮液©，单独抽气后将两溶液混合。
30%胶液的配制：贮液⑥：贮液⑥：贮液© = 2: 1 : 1(体积比），取3.5ml贮液 ®，加1. 75ml贮液@，混合后抽气，再取1. 75ml贮液©，单独抽液后将两液混合(注意： 贮液④要在灌入梯度混合器前临时混合，以免胶液过早聚合）。
制备4%〜30%的梯度胶-灌胶:将7ml 4%的胶液加入贮液瓶，7ml 30%的胶液 加入混合瓶。打开电磁搅拌及梯度混合器的开关，接着起动蠕动泵，将梯度混合器中的溶 液缓缓输入凝胶中。事先将输液管出口由凝胶膜上口中央伸向底部，随着凝胶膜内液面的 升高逐渐提高输液管，使管口始终接近液面而不伸进液体内部。控制流速在lml/min〜 2ml/min，约lOmin灌胶完毕。
于梯度胶面上小心加入25%乙醇约3mm高。静置30min后即可聚合。
待胶液聚合后，取出上面含醇的水层，取2ml 4%胶液洗梯度胶面，吸出后，再加 3ml 4%胶液于梯度胶上，于此胶液中插入样品槽模板，使其下沿刚好接触梯度胶面而不 要伸进胶内。再于此胶液上小心加入2mm〜3mm高的水层，静置，待聚合后，于室温放置 老化半小时后方可使用。
预电泳小心取出样品槽模板，用滤纸条吸去槽内的水分。于两个电极槽内加入电 极缓冲液，接通电极槽中冷却回流管和自来水管，然后接通电源，上槽接负极，下槽接正 极，维持电压70V，预电泳20min。
加样标准蛋白质样品的制备:将5种标准蛋白质样品按lmg/ml的浓度溶于含 20%蔗糖的电极缓冲液中，加入5W 0. 1%溴酚蓝溶液作指示染料，混合后加入样品槽内。 通过指示染料在样品槽内的分布可以直接观察加样情况。
待测样品的制备同标准蛋白质。
在测定分子量时，待测样品和标准样品要在同一个凝胶片上进行电泳。
电泳接通电源，将电压调至70V，电泳15min后样品缓缓进入胶内（30min后染料可跑 出胶片）。
接通并起动蠕动泵，开始使上、下两电极槽中电极液回流。
将电压升高到150V，维持恒定电压，电泳15h〜16h。电泳至少要2 OOOVh，若冷 却条件好，可升高电压，缩短电泳时间。
固定、染色、脱色
固定：电泳结束后，取出凝胶片，置培养皿内，用固定液浸泡30min。
染色:将固定过的胶片用染色液浸泡过夜。
脱色:可用以下两种方法脱色：
电泳脱色：将染过的胶片夹在两片塑料纱之间，垂直放在装满7%乙酸的电泳槽 内，电极位于塑料纱两侧，维持电压24V，电泳45min。
扩散脱色:将胶片浸于脱色液内，每隔2h换1次脱色液，直到胶片出现无色透明清 晰的谱带。若同时采用低于50‘C的水浴加温，可缩短脱色时间。
分子量的测定
标准曲线的制作:以凝胶片的前沿或迁移距离较大的标准蛋白质为参考点，计算 每种标准蛋白质的相对迁移率(Ms)。
M 蛋白质从原点迁移的距离
从原点到参考点的距离 .
以值为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上制作标准曲线。
未知样品分子量的测定:测定出未知蛋白质的相对迁移率，利用标准曲线便可计 算出分子量。
