蛇毒蛋白的分离技术 超速离心技术

一、基本原理

悬浮液静止不动时，由于重力场的作用悬粒逐渐沉降，粒子越重，下沉越快，反之，密 度比液体为小的粒子就向上浮。微粒在重力场中移动的速度与微粒的密度、大小和形状有关，并且又与重力场的强度和液体的粘度有关。像红细胞大小、直径为数微米的微粒可以 利用重力作用来观察它们的沉降速度。蛋白质分子则不可能仅仅利用重力作用来观察它 们的沉降速度，因为蛋白质分子微粒越小，沉降越慢，而扩散现象越严重，所以需要利用高 速离心方法以产生强大的离心力场。离心力场(G)可以由离心机转头的角速度(u>，以弧度 /s表示)和微粒离旋转轴的辐射距离(r，以cm表示），按如下方程式来决定:G=0)V

因为转头旋转1次等于2;r弧度，所以转头的角速度以每分钟旋转的次数（转数/

mm)可以表示为因此，离心力场也可以表示为：

离心力场G=(2jtX转数/s)2r。例如，如果超速离心机的转速为60 000转/min(即1 000 转/s)，而离心池中心至转轴中心的距离为6cm，如下式所示，   这表明在此情况下所产生的离心力比重力大24万倍，利用这样大的离心力，就有可 能研究胶体粒子大小范围内的各种微粒和分子的沉降行为。在报告特殊颗粒离心分离的 条件时，转头的转速，半径的大小，转头运转的时间都必须表示出来。但通常记录的是以旋 转时离心管中液柱的平均半径(即从离心管液柱的中间到旋转轴的距离)而计算到的、以 g为倍数的离心力。在实际工作中，为了方便起见，不需要计算，从Dohe与Cotyias制作 的与转头速度和半径相对应的尺的列线图中得知此三者之二，就可以推算另一数值， 往往都是知道每分钟的转速(r/min)与旋转半径，然后在此列线图中即可查出相对 离心力(g)。图3-13-13所示，如已知离心机的每分钟转速和旋转半径，即可查出相对离心 力，例如每分钟转速为3 000,旋转半径为6cm，则相对离心力约为600g。

在离心分析中，经常遇到沉降系数这个概念。沉降系数是指单位离心力作用下颗粒沉 降的速度，用表示，简化为5，数量单位为S。1个S等于1X1(T13s。近来常用沉 降系数来描述生物高分子或亚细胞器的大小。蛋白质的沉降系数一般在1S〜200S单位 之间。

沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。

超速离心法分为两大类型，一类为制备性超速离心，一类为分析性超速离心。

二、制备性超速离心

(―)差速分级离心法

差级分速离心法亦称差级离心法，是最常用的离心法。这个方法是建立在不同大小和 密度的颗粒在沉降速度上存在着差别的基础上。被分离的物质通过离心力逐渐增加(分 步)施加的离心场可以分成很多组分。每一步的离心场力被选择到能使一种特殊类型的物 质在预定的离心时间内沉降以得到一个“沉淀”，每一步末了，分离沉淀与“上清液”，沉淀 经过几次“洗涤”后，最后得到一个“纯”的部分。在这种离心中，离心后一般以倾倒的办法 把上清液与沉淀分开，将分离的上清液再加高转速进行离心，分离出          第二部分沉淀，如此 往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。这种差速分级离心法对于从匀浆的组织中分离 细胞器可能是一种最常用的方法。对于分离在大小和密度上有显著数量级差别的细胞器， 这种方法是最成功的。在蛋白质的提取纯化中，往往也采用差速分级离心法，将匀浆中不 需要的组分去掉，得上清液后再用其他方法纯化之，因此在蛋白质溶液的纯化中首先就用 此方法，然后再用层析法与电泳法等纯化之。差速分级离心法如图3-13-13所示。

提高分离能力，乃发展了另 一重要离心分离法，即区带离 心法。区带离心法又分为三种 类型:①差速区带离心法;②等 密度区带离心法;③平衡等密 度区带离心法。 (二）差速区带离心法 此法亦称为分级区带离心 法，是由于不同颗粒的不同沉 降速度而分层,故称为差速区 带离心法。为了得到高的分离 能力，在区带离心法的运用中 需要在离心液内形成密度梯 度。常用的梯度溶液为蔗糖密 度梯度溶液，其主要目的是为 了稳定离心液，避免产生对流， 因为对流会由于局部的温度变 化或机械振动而引起干扰，影 响分离效果。差速区带离心时 需要使离心管成水平位置(垂 直于转子轴）,离心管内溶液要 生形成密麽梯麽.例加加入港应注意的是，差速分级离心沉淀法所分离的组分往往不是均一的，为了克服这一缺

糖溶液使其浓度自离心管底部至液面分布范围为10%〜40%，即造成密度梯度的分布， 越近管底密度越大。离心前把要分离的混合物小心地放在液面上成为很薄的一层，离心开 始时很慢,避免扰乱溶液的密度梯度和加样层。离心后可以分 成区带，最后停止离心。一般在离心管底部开一小孔，分别收集已经按微粒大小分布的区。