一、测定方法的建立
蛋白质的纯化中，70%以上是酶的纯化，因此建立蛋白质的测定方法，常常是建立酶 的测定方法。一种有用的酶的测定方法必须符合4个标准:①绝对特异性;②高度灵敏性; ③高度精确性;④经济简便。虽然常常有必要对这些标准采取某些折衷办法，但应该强调 指出，放弃任何实质性的要求会严重地限制一个测定方法的普遍应用。对任何测定方法的 根本要求是其特异性，因为大多数酶的测定法是检测其底物的减少或产物的增多，这就必 须注意确信只有一种酶活性与被检测的效应有关。例如磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶 的测定。该酶催化如下的反应：
PEP+C02+GDP =OAA+GTP
若以测量PEP的减少或OAA(草酰乙酸)的生成来测定该酶的活性，就可能出现很 大误差，除非证明下列各种酶活性不存在。例如：
PEP 羧化酶:PEP+HC03- —»OAA+Pi
丙酮酸激酶:PEP+ADP —-丙酮酸+ATP
PEP 羧基转磷酸化酶:PEP+C02+Pi —-OAA+PPi
这些问题在纯化作用的最初阶段尤为敏感，因此时随便哪个反应所需要的底物都可 能存在。确定一种测定方法的特异性，最令人信服的办法是通过在各种情况下研究对辅因 子的要求和产物的鉴定，因为对于几乎任何酶都可举出类似的例子，所以我们必须知道可 以导致某种产物的聚积或底物的利用的各种可能的反应。
在纯化的起初阶段，大多数酶的活性是很低的，因此测定方法必须高度灵敏。随着纯 化进程的深化，对灵敏度的绝对需要也逐渐降低了，但是，以不灵敏的方法来进行测定，所 用的酶量越大，就越不适用于其他目的。
一种酶测定法的准确度和精密度通常取决于所采用的技术的化学基础。例如，倘若有 一个测定方法涉及酶促生成的醛与苯肼起作用产生苯腙的反应，这个反应是在pH不适 当的缓冲液中完成的，即pH明显大于6时进行的，所观察到的生成苯腙的速度并不准确 地反映酶促产生醛的速度，而是反映生成苯腙的化学反应速度。一个测定法的准确性是反 映测量值与真实值的接近程度，而精密度则是反应同一样品在两次测定或三次测定中所 出现的离散情况。例如，假使有一种测定方法作了 10次同样的测定，所得的实验值在平均 值的士5%范围内，那么这个测定方法对于检测远低于20%的变化是没有什么价值的。比 色测定方法特别容易碰到这种问题。
最后还有一点要考虑的是，所用的测定方法要经济易行。在纯化过程中，在每一步骤 之后对所纯化的酶的活性都要追踪检查，用以追踪检查的方法简易，多半能说明测出的酶 活性与实际上的活性是相近的。
蛋白质纯化工作选材是很重要的，选材好，工作进展较快，成绩就大;选材不好，工作 进展慢，则成绩小，有时甚至造成此项工作不能进行下去。高尚荫教授根据他半个世纪的 病毒研究工作经验提出：成功的科学研究工作有3个主要因素，就是材料、技术和人员。可 见研究材料选择的重要性。一个研究工作者可能有选择某一要纯化的分子的来源的自由， 也可能没有。如果目的是为了得到大量的某种蛋白质以研究该蛋白质本身，或用作其他研 究，则任意选择的可能性就很大。如果纯化的目的是被研究系统中的一种特殊成分，则选 择来源的自由就受限制了。不论何种情况,都要考虑怎样加快纯化过程。纯化作用实质上 是一种浓缩过程，在纯化过程中要分离的蛋白质被浓缩了，而其他的细胞蛋白质则没有被 浓缩，因此当要分离的蛋白质在总细胞蛋白质中占的份额增加时，它的纯化就容易了。选 择一种好的酶源的关键是量。应当寻找含有大量要分离的蛋白质的组织，并且这种组织还 要容易大量得到。在这方面首选者是大家畜如牛、猪、山羊等的脏器。另一个来源是微生 物。许多微生物例如酵母和细菌等容易生长或价钱便宜，容易大量低价购到。
