蛇毒 类凝血酶的分离纯化

响尾蛇毒和蝰蛇毒含有类凝血酶，特别是蝮亚科蛇毒更以富含类凝血酶著称。类凝 血酶具有精氨酸酯酶活性，能够直接作用于纤维蛋白原而使其凝固，其作用结果和人或牛 的凝血酶相似，因而称之为类凝血酶。对类凝血酶的分离工作做得很多，许多蛇毒中的类 凝血酶得到了纯化和部分纯化，这里介绍管丰利等(1982)从浙江产蝮蛇毒中分离、纯化类 凝血酶的过程。鉴于蛇毒昂贵，有些步骤是为了综合利用而设的，读者可根据自己的情况 制订纯化步骤。

1. Sephadex G-25 柱层析为 了综合利用蛇毒中各种活性组分，

先用Sephadex G-25分离活性小肽 ——舒缓激肽增强因子。取21g粗 毒，共分为7批，每批3g,溶于10ml pH7. 2,5. Ommol/L磷酸缓冲液（内 含0.1mol/L EDTA)中，离心取上 清液上柱（4.0cmX 65cm)，用内含 10—4mol/L EDTA的同一磷酸缓 冲液洗脱，层析图谱如图3-13-35 所示。经Sephadex G-25分离后，大 致分为二部分，即先洗脱的大分子 蛋白质及后洗脱的小分子多肽。后者用于提取激肽增强因子，将前者的收集液合并供下一步纯化。

DE-11纤维素柱层析将上述合并液直接上事先已用pH7. 2, 5.0mmol/L鱗酸 缓冲液平衡过的DE-11层析柱(4.0crnX95Cm)，然后用不同氯化钠浓度的同一磷酸缓冲 液分级洗脱。          第一个蛋白峰(No. 15〜50)收集后用于磷脂酶A2的制备。具有精氨酸酯酶 活力的峰，经生物活力鉴定， 第一个丶 第二个酯酶峰为激肽释放酶,但混杂有类凝血酶活 力。第三个酯酶峰为类凝血酶（No. 110〜124),突触前神经毒素位于其后（No. 127〜 163)，如图3-13-36所示。分别合并洗脱液，对蒸馏水透析后冷冻干燥备用。

DE-52层析取上述凝血酶组分冻干物100mg溶于10ml的pH8. 0,5. Ommol/L 磷酸缓冲液中，并用同一缓冲液平衡DE-52纤维素柱(1. 5cmX14cm)。上样后用不同浓 度的NaCl直线梯度洗脱。层析图谱如图3-13-37所示。精氨酸酯酶活力测定显示有一个 主峰和二个小峰。主峰即为类凝血酶组分。其后的杂蛋白峰呈黄色，很可能是含核黄素辅 基的L-氨基酸氧化酶。合并酯酶活力的主峰部分用饱和硫酸铵反透析沉淀，收集沉淀并 用pH8. 0,5. Ommol/L的磷酸缓冲液透析平衡，再在DE-52纤维素柱上重层析一次，又可 除去部分杂蛋白，如图3-13-38所不。

Sephadex G-75凝胶过滤将上述纯化的类凝血酶20mg 溶于lml0.2mol/LNa- C1、0. 02mol/L NaHC03 中，样品上于 Sephadex G-75 柱（1. 3cmX150cm)，并以同一溶液 洗脱，可得一对称的蛋白峰，如图3-13-39所示。它与精氨酸酯酶的活力峰相吻合。生物活 力测定表明，它能使纤维蛋白原凝固，此即提纯后的蝮蛇毒类凝血酶。

提纯后的类凝血酶在7. 5%或10%浓度的聚丙烯酰胺凝胶电泳上都呈一条带。用过 碘酸-Schiff’s试剂作糖蛋白染色也同样可得到一条粉红色区带，位置与蛋白区带一致，说 明蝮蛇毒类凝血酶为一糖蛋白。

十一、X因子激活剂的分离纯化

蛇毒中含有X因子激活剂，但分布不太广泛，这里介绍Helene Hofmann等(1987)从 矛头蝮蛇毒中分离X因子激活剂的过程。
 DEAE-Cellulose 层析矛头峻（5沉<^mr)蛇毒溶于 pH7. 5，10mM Tris- HC1缓冲液中（含5mmol/L Benzamidine)并对该溶液透析。经过透析后的样品上DEAE- Cellulose 柱，用 Omol/L 〜0. 2 mol/L NaCl线性梯度洗脱。

50mmol/L Tris-HCl 缓冲液(含 100mmol/L NaCl 和 5mmol/L 苯甲脒)平衡，洗脱时也用该缓 冲液，在41：下操作，流速为 8ml/h。如图 3-13-40 和图 3-13-3. DEAE-Cellulose 柱层析 把图3-13-38和图3-13-39中 含有X因子激活剂的组分合并分 别上DEAE-Cellulose柱，可获得 纯的X因子激活剂蛋白。

十二、凝血酶原活化 因子的纯化

有些蛇毒中含有凝血酶活化 因子，其中包括锯鱗蝰 泰攀蛇蛇毒。这里介绍

Frederick等（1980 )从泰攀蛇 蛇毒中分离纯化凝血酶激活 因子的过程。

Ultrogel-22 层析取出 100mg 的泰攀蛇（

3ml pH5. 8，0. 05mol/L NaAc (含0. 15mol/L NaCl)中，在 22°C 条件下上 Ultrogel-22 柱（1. 5cm X 100cm)，每管2. 5ml分部收 集，见图3-13-42。

QAE-Sephadex-Q50 层析 把          第一步分离的          第35〜          第45

管收集，在22°C条件下上QAE- Sephadex-Q50 柱（0. 9cm X

30cm)。该柱用 pH5. 8,0. 05mol/L NaAc 缓冲液(含 0. 15mol/L NaCl)平衡，用 0. 15mol/ L〜0. 6mol/L直线梯度洗脱，总体积100ml，每管2ml分部收集，如图3-13-43所示。

十三、血小板聚集诱导因子的分离纯化

有些蛇毒组分可以诱导血小板的聚集和释放，而有些能够抑制这种反应。血小板聚集 激活因子可以分为两类：①具有酰胺水解活性的丝氨酸蛋白酶，如从矛头蝮

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(Soi/iro/^ aimr)蛇毒中分离出的血小板素和从响尾蛇(Crota/奶 Aorr/<it« Linnaeus)蛇毒 中分离的Crotalocytin。②          第二类是非酶类物质。除此之外，还有其他组分如PLA2等也可 以引起血小板聚集。这里介绍Ouyang等(1986)从r/i0<ios<0OTa蛇毒中分离血小 板聚集诱导因子的过程，这种诱导因子可能属于非酶类物质。

1. Sephadex G-75 柱层析用 pH7. 2,0. Olmol/L 碳酸铵缓冲液平衡 Sephadex G-75 柱(柱体积600ml)，用同样溶液溶解0.6g粗毒，离心除去沉淀后上柱。用平衡液在4°C 条件下洗脱，流速36ml/h，每6ml收集一管，如图3-13-44所示。