蛇毒 其他毒素及活性组分的鉴定

蛇毒中有一种组分主要作用于局部组织，引起肌肉坏死，因而造成肢体残废的毒素， 称为肌肉毒素或肌肉坏死毒素。这种毒素使被咬的伤肢的肌肉、肌腱，甚至软骨坏死脱落， 导致肢体永久性功能障碍，甚至不得不截肢残废。在各种蛇毒中以响尾蛇科，包括蝮亚科 蛇毒的肌肉坏死作用最强，其次是眼镜蛇科及蝰亚科蛇毒。

测定肌肉毒素，可用动物实验。给家兔肌肉注射蛇毒或分离组分，中毒肌肉做成组 织切片用显微镜检查，然后计算肿胀和坏死程度。这种方法适用于实验室。

在临床上，目前亦发现中毒后血清肌酸激酶水平的变化与局部组织损伤或坏死的程 度是一致的。因此，定量地测定血清肌酸激酶值作为判定肌肉坏死程度的指标，将非常有 利于实验室研究和指导临床治疗。假如在蛇伤的早期阶段就能对咬伤的局部损伤组织，定 量的测出可能损伤(主要是由肌肉毒素引起的肌肉坏死)程度，及时采取针对性的防治措 施，就有可能大大降低残废率和截肢率。

(―)肌溶活性的测定(康莲娣等，1983)

用0. 15mol/L NaCl溶液配制蛇毒或蛇毒组分，浓度在0. 5mg/ml左右，在白鼠腮肌 内注射0. lml，12h后剥离注射部位的腿肌用戊二醛和锇酸固定，然后用丙酮逐级进行脱 水，环氧树脂618包埋，在超薄切片机上切片，醋酸铀和柠檬酸铝干燥，最后在HU-11 电子显微镜上观察。计算肿胀和肌坏死的程度。本方法只能在实验中应用，不能应用于 临床。

(二）血清磷酸肌酸激酶测定

磷酸肌酸激酶(简称CPK)广泛存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，心肌梗死、肌肉损伤 等可以引起CPK活性增高，某些蛇毒的肌毒素也可以引起CPK浓度升高，临床上可以用 CPK的活性来衡量肌肉被损伤的程度。CPK催化下列反应：

测定磷酸肌酸激酶的方法很多，利用上述正逆反应均可测定。主要有分光光度法和光 电比色法两类。分光光度法反应灵敏，结果比较准确,但需要特殊的酶制品及紫外分光光 度计，故目前尚不能在一般化验室开展。现较常用的是下列两种比色法:一种是利用正向 反应，生成不稳定的磷酸肌酸。磷酸肌酸在当量酸溶液中，室温下30min即全部水解生成 磷酸(此时ATP、ADP仍稳定），再测量磷酸量，根据生成磷酸量的多少计算出酶活力。另 一种是利用逆向反应，此时磷酸肌酸和ADP在酶作用下生成肌酸，肌酸和双乙酰及萘 酚结合生成红色化合物。在一定范围内红色深浅与肌酸含量成正比，根据生成的肌酸量的 多少，计算出酶活力。上两法相比，用磷酸肌酸为底物的方法，在合适的条件下，反应速度 比用肌酸为底物的方法快6倍，且不受无机磷的干扰。这里介绍这一比色法。

血清磷酸肌酸激酶肌酸显色法测定如下：

原理磷酸肌酸和ADP在磷酸肌酸激酶的催化下变成肌酸和ATP，生成的肌酸 与a-萘酚和双乙酰反应，生成红色化合物，在一定范围内，红色深浅与肌酸量成正比。与 同样处理之肌酸标准液比色,求得酶活力。

试剂

混合底物

pH7. 4三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)2. 42g，加蒸 馏水至100ml，再加入0. 2mol/L盐酸88. 8ml及无水硫酸镁(MgSO4)0. 34g，调节pH至 7.4。此液室温中可保存数月。

0.012mol/L磷酸肌酸溶液:称取磷酸肌酸钠0.436g，加蒸馏水至100ml,调节pH 至7. 4,保存于一25€或冰箱上层冰盒中，可用1个月左右。

0. 004mol/L二磷酸腺苷溶液:称取二磷酸腺苷钠盐0. 233g，加蒸馏水至100ml，调 节pH至7. 4,保存于一25°C或冰箱上层冰盒中,可保存1个月左右。

临用前取上述①、②、③试剂各l0ml混合，在此混合底物30ml中，加入盐酸半胱氨 酸0.105g，调节pH至7. 4。此试剂较好新鲜配制，也可保存于冰盒内，一般可放5天〜7 天，若空白管吸光度太高，说明有游离肌酸产生，即不能再用。

0. 15mol/L氢氧化钡溶液:称取氢氧化钡〔Ba(OH)2 . 8H20〕4. 73g，加蒸馏水使 溶解(可加热助溶)并稀释到l00ml。

5%硫酸锌溶液：称取硫酸锌（ZnS04 . 7H20)8.8g，加蒸馏水溶解并稀释到 100ml .上述(2)、（3)两种溶液配好后需进行滴定，可按下法进行:吸取5%硫酸锌5ml，放于 50ml三角烧瓶中，加入酚酞指示剂2滴，用0. 15mol/L氢氧化钡溶液滴定直至出现粉红 色为止。氢氧化钡用量应和硫酸锌相等，如不相等可稀释较浓的溶液。

标准肌酸溶液（1. 7nm0l/L):准确称取无水肌酸22. 3mg，置于100ml容量瓶中， 加蒸馏水使溶解并稀释至刻度。放冰箱(4°C)保存，可用数日。

双乙酰溶液:先配成1%水瑢液，置棕色瓶内放冰箱中。临用时加蒸馏水稀释20 倍。

贮存碱溶液：称取氢氧化钠30g，无水碳酸钠64g，加蒸馏水使溶解并稀释至 500ml。室温低时可析出沉淀，此时应放于37°C.水浴中，待沉淀溶解后再使用。

a-萘酚溶液:称取a-萘酚lg，用上述贮存碱溶液使溶解并稀释到100ml。此液必须 新鲜配制，否则空白管吸光度读数增高。

操作见表3-14-3。

表3-14-3磷酸肌酸激酶显色法测定操作步骤

离心3min〜5min

如呈色明显清晰透明，最后一次离心可以省去。用520nm波长滤光板进行比色，读取 各管吸光度读数。

单位定义以lml血清在37°C与底物作用lh，生成lftmol肌酸为1个磷酸肌酸 激酶活力单位。

正常参考范围0〜3.2IU。

(三） 舒缓激肽增强肽(BPP)

检测方法(何子安等，1981):

取体重300g〜400g豚鼠，雌雄不拘，猛击头部致昏，立即开腹，取回肠15cm，用经 95%02-5%C02混合气体饱和的Kreb’s营养液冲洗肠腔内容物。在靠近回盲部取回肠 1. 5cm〜2. Ocm，细心剥离纵行肌,两端用线缝扎，一端固定于玻璃容器底部，此容器装有 10ml Kreb’s溶液，并不断地通过95%02-5%C02混合气体，整个容器置于371：水浴中。 纵行肌的另一端连接在应变器的反变片上。预先加张力lg，稳定30min后开始给药，用微 量注射器注入一定量的舒缓激肽，纵行肌开始收缩，收缩幅度通过应变片肌肉等长收缩仪 传动描记。由于动物有个体差异，舒缓激肽的取量一般在0. 05/xg〜0. 5Mg之间，寻找一个 使收缩幅度适中的量。以BPP在离体豚鼠回肠上增加舒缓激肽收缩作用的能力来作为 BPP活力测定的指标。加入固定量舒缓激肽，收缩至峰顶时，用Kreb’s溶液冲洗3次〜5 次，待3min〜5min纵行肌恢复到原先自发收缩幅度以后，加入适量的BPP(大约为2叩/ ml)，保温15s，再加相同量的舒缓激肽，此时，纵行肌的收缩幅度较之舒缓激肽本身有明 显的增加。规定对照的幅度为1，增加后的收缩倍数即为BPP的相对活力，相对活力再除 以BPP样品溶液的蛋白浓度值，即为相对比活力。

(四） 毛细血管通透因子

检测方法(Milos等，1955):

把体重2kg〜2. 5kg的家兔毛拔去，24h后静脉注射20mg Evans蓝,Evans蓝用生理 盐水配制，浓度为1%。继之在皮下注射待测样品溶液，注射量以鼓起直径为9mm〜 11mm的泡为准。60min后处死家兔，剥皮并按原来大小固定在玻璃板上，测定注射样品 处染料扩散区域的大小，如直径等于或大于9mm〜11mm，说明该样品对毛细血管的通透 性起增加作用。用生理盐水作对照，对照点应看不出有染料扩散。

(五） 细胞凝集素

检测方法是把血小板和待测细胞制成4ml的5. 0105细胞悬液(用Hank液配制）， 取0.9ml细胞悬液加0.1ml细胞凝集素（用Hank液配），混匀，细胞凝集素的浓度为 10Mg/ml〜1 000Mg/ml。在37°C下保温，半小时后每隔一定的时间搅动一次，肉眼观察细 胞的凝集情况，在显微镜下照相，并比较和植物凝集素PHA之间的差别。

(六） 神经生长因子(NGF)生物学活性鉴定

按Maximov双盖片法进行培养。培养材料为9天鸡胚的背根神经节。培养基组成为： 1/3雄鸡血浆,l/3Eagle’S MEM培养液(补加凝血酶原0. 5mg/ml)和1/3待检测的样品 液。培养基体积为3cm3。样品用Hank液倍数稀释，使之成为一系列不同浓度，每个浓度 做5个培养，对照组加入不含样品的等量Hank液，培养温度为37士0. 5 °C，时间为18h。