(一） 半数致死量(LD5Q)的测定
选20±2g小白鼠，雌雄不拘，分成4组，每组10只，蛇毒按等比级稀释。每只小白鼠 腹腔注射0. 2ml，24h后观察致死之动物数，用Litchfield和Wilcoxon的统计法计算LD50 的值。全数致死剂量LD:。。按相似的方法测定，以最小全数致死剂量为其毒性剂量LDw。
(二） 亚急性毒性实验(覃公平等，1986)
该方法一般适用于检测连续用药动物可能产生的副作用，本实验用清栓酶为例。
选40只全系无孕雌鼠，分成5个组，每组大鼠8只，其中设对照组1个，实验组4个。 给药剂量以临床用药量为基础（0. 004IU/kg)，设临床用药量的1. 7倍（0. 0069IU/kg)、 2. 9 倍(0. 115IU/kg)、5. 8 倍(0. 023IU/kg)及 28. 8 倍(0.115lU/kg)4 个组。给药方法为 皮下注射，给药时间为临床用药的一个疗程（21天）。用药为每日注射一次，体积为 1. 0ml，按各剂量组稀释后给药，对照组注射生理盐水。对各组实验动物进行如下观察:① 日常行为，如进食、进水、活动状况等;②体重、贤功能（以尿素氮为指标）、血象检查(血小 板、白细胞数）;③各脏器组织学检查，方法是用药21天后把40只大白鼠全部处死，进行 各脏器的组织学检查、中毒性损伤的病理形态判定。以实质器官细胞的严重变性及坏死作 为观察指标，特别是肝细胞及肾曲管上皮细胞，其次是心肌纤维细胞;对血管壁及血液的 毒性损伤的病理形态学判定以实质脏器的出血情况为观察指标，包括血管周围血液成分 及血浆渗出，特别是以肺、肾作为重点观察脏器，肾脏检查曲管内有无管型形成。
(三） 药物代谢动力学测定
在实验的前1天，用高浓度碘化钾溶液灌服家兔甲状腺，静脉注射经1251标记的毒素 或组分，然后在不同的时间间隔取血，测定其放射强度。注射同位素标记的毒素5h后处死 家兔，分别取各脏器lg测定放射强度。根据牛顿-高斯法编程序，在微机上拟合血液中放 射性活度-时间曲线，并计算出药物代谢动力学模型参数。从各脏器、组织的放射性强度， 可以知道毒素进入体内的分布及代谢、排泄途径。
(四） 出血毒素结合动力学测定
现在有人(韦传宝等，1989)用1251标记出血毒素，研究标记后毒素与肾匀浆组织的结 合动力学，从而推断出血毒素在体内是否有特定的作用位点，步骤包括：
出血毒素的标记根据Gumaa(1971)的方法，用1251标记从毒中分 离的出血毒素I (AaH I )，AaH I的用量为100Mg，标记后用SephadexG-15把125I-AaH I和游离1251分开。洗脱液为0. 05mol/L pH7. 4的PBS，流速为36ml/h，每0. 6ml收集1
管，放射性强度用FJ-1901Y谱仪测定，对含有125I-AaH I的试管进行收集，3天内用完。
游离1351的测定。取收集的125I-AaH I液lOOfxl，兔血清50/xl,15%三氯醋酸200M1沉 淀离心，测定上清液的放射性强度。上清液的放射性由游离1251引起，游离1251产生的放射 活性应小于5%。
家兔肾匀浆组织的制备用空气针处死家兔，取出肾，冷冻至一1CTC，每个肾加
5ml预冷(4。0的Buffer A，然后在匀浆器上以3 OOOr/min速度匀浆5min。每个肾匀浆组 织加20ml预冷(4°C)的Buffer A，用两层纱布过滤，滤液在500r/min条件下离心lOmin， 弃去上清液，沉淀混匀后即为肾勻浆组织。其他勻浆组织也按类似的方法制备。
3.结合动力学的测定所有反应体系都含有肾匀浆组织Buffer A和125I-AaH I。 在测定AaH I对125I-AaH I的竞争结合作用时，反应体系还含有未标记AaH I。当结合 反应完成后，对反应液进行离心，弃去上清液，沉淀用Buffer A洗3次，每次lml，把洗涤 后的沉淀从Eppendorf管转移到同位素测量管中，用FJ-1901r谱仪测定其放射强度，数据 以曲线的方式表示。用这种方法可以测定不同组织和125I-AaH I的结合强度，肾匀浆组织 与125I-AaH I结合的时间饱和值，浓度饱和值和AaH I的竞争结合强度。
从125I-AaH I与肾组织结合的时间饱和曲线可以知道，125I-AaH I结合作用在lmin 内达到饱和。用不同量的125I-AaH I (s)和一定量的肾勻浆组织结合30s，用高速离心法中止反应，经洗涤后测放射强度(v)，以|对|作图，从曲线中可求出KD和VMX值。
(五） 测痛方法
蛇毒中有不少组分可以引起疼痛和止痛，建立定量的测痛方法十分必要。测痛方法有 多种，这里介绍电刺激鼠尾——嘶叫法(印其章，1979)。测定前1天〜4天注射蛇毒组分， 测定时先将动物安放于特制的固定架上，待动物安静后测定基础痛阈。然后根据分组要求 按计算好的药物量进行微量注射，完毕后5min、lOmin、15min、20min、30min、40min及 60min时各测痛1次。为了避免反复过强电刺激引起鼠尾组织损伤，规定较高刺激强度为 1. OmA，如果强度已达1. OmA而动物仍不嘶叫则立即停止刺激，并以1. OmA作为此时 的痛阈。镇痛效应用镇痛指数A/)来表示，
另一种比较简单的方法称作甲醛爪内注射——行为法（简称为甲醛法，邸石等人， 1981)，在大鼠右侧前爪背面皮下注射5%甲醛溶液50)ul，注射后半小时将动物置于特制 的有机玻璃箱内观察其行为反应，根据动物注射爪和地面的相对位置，将疼痛程度分为四 级：
0级一两前爪均匀对称地置于地面,活动无异常；
I级一注射爪轻微接触地面，活动时明显跛行；
I级一注射爪抬起，不接触地面；
I[级一舐咬或摇动注射爪。
实验时，每分钟观察15s，记录该15s内出现的较高痛级，连续观察30min，将记录到 的痛级按时间顺序计算各30min时间段内的痛级的均值，以此作为痛级均数，PIR用以衡 量镇痛效应，PIR越小表示镇痛作用越强。
(六） 水肿诱导活性测定
把15g〜18g的小鼠分成若干组，每组4只〜6只，把待测组分或蛇毒溶于生理盐水 内，配制不同浓度溶液。在小鼠后腿的足垫部位进行注射，注射的体积为20/xl，45min后用 断脑法处死小鼠，在踝关节处把双脚切下分别测其重量，由水肿造成的重量增加可以用水
370 中国毒蛇学
肿率来表示。水肿率按下式计算:
把引起水肿率120%的剂量称为最小水肿剂量。
(七）蛇毒组分金属离子含量的测定
用原子吸收光谱法测定蛇毒组分所含的金属离子种类，以透析液为对照，所有的溶液 都是绝对用无离子水配制的。原子吸收光谱仪——有WYZ- I型光谱仪(中国.沈阳)等。 通常都是测定透析前后样品原子吸收光谱并进行比较，透析液为内含螯合剂的缓冲液(如 Tris-HCl)，一般用邻-菲咯啉作为螯合剂。透析作用在4X：条件下进行72h左右，其间换4 次〜6次透析液。样品中的螯合剂可以用Sephadex G-25柱层析除去。
可以测定除去金属离子后样品的活性，从而可以搞清金属离子在维持活性方面的作 用。
(八） 人血小板悬液的制备
在测量蛇毒中血小板功能抑制因子或激活因子时，经常需要血小板，这里介绍血小板 的制备方法：人血液和EDTA轻轻地混合，EDTA的最终浓度为3mmol/L，在90g的条 件下离心lOmin，上清液在500g的条件下离心lOmin，血小板沉淀下来，血小板用不含Ca 的PBS(pH7. 4)洗2次，洗后的血小板悬浮于同样的溶液中。
(九） 血小板中环核苷酸的测定
有些血小板功能抑制因子对血小板中cAMP和cGMP的含量产生影响，测定方法如
下：
血小板中cAMP和cGMP的测定按Zhang等(1980,1983)的方法进行，在这里略作 修改。0. 5ml的人血小板悬液和抑制因子混合，在37°C下保温15min，对照用PBS代替抑 制因子。反应完毕后加高氯酸并在80°C温度下加热5min中止反应，然后在1 200g的条件 下离心lOmin，上清液用KOH中和并重新离心，最后上清液在一45°C下贮存。cAMP和 cGMP的含量用放射免疫测定的方法进行，其过程按同位素标记物所附的说明书进行。
(十）回肠纵、环肌标本的制备
用豚鼠25只，体重250g〜350g，兔15只，体重1.5kg〜2kg，雌雄不拘。猛击其头部致 昏后，立即由距回盲部20cm处起，向上截取回肠15cm，用Kreb’s液冲洗干净，制备纵肌 和环肌标本。制备标本按K0SterlitZ(1970)法，把纵肌和肌间神经丛从肠壁上分离下来，称 为分离纵肌标本(实为肌间神经丛纵肌，MPLM)。将肠壁的剩余部分沿环肌走行的方向， 交错对切，切成的肌条即为分离的环肌标本。因该标本内的横向环肌经交错对切后，已改
为纵向对接排列，故便于记录收缩反应。
(十一）环肌收缩反应的记录
将欲对比观察的2个肠肌标本同时安放在一个容积为7ml的浴槽内。浴槽内充满改 良Kreb’s液，通95%02和5%032,恒温37°C。2个标本悬挂在一对铂金电极之间。因2 个标本在同一浴槽内，故药物的作用条件是相同的。2个肠肌标本的收缩反应分别通过2 个换能器输入LM12-YT多道记录仪上，同时记录，观察并对比收缩速度、频率的变化。凡 进行比较的数据均作t检验处理。
(十二)免疫酶标电子显微镜样品的制备(何华平等，1988)
为了确定毒素在体内是否存在特异性结合，免疫酶标电镜法是一种有效的方法，下面 以从A ^⑶加蛇毒中分离的出血毒素I (AaH I )为样品，介绍酶标电镜样品的制备。
家兔致死后迅速解剖腿肌，取一小块立刻投入经液氮预冷的正己烷中，稍后用锋利刀 片将肌块修成约2mmX5mmX7mm小块，控制厚度在25/ini进行冰冻切片，蒸馏水中迅 速展片后捞到载玻片上，放潮湿培养皿中，将经辣根过氧化酶标记的AaH I (简称HRP- AaH I )滴在组织切片上，浸没处理lh后用0. 2mol/L pH7. 2 PB充分漂洗，加入HRP 底物、H202和3,3^二氨基联苯胺四酸盐，显色30min，用0. 2mol/L pH7. 2 PB充分漂洗， 经过常规电镜制片过程，最后在HITACHI 800型分析电镜上观察。
HRP-AaH I用过碘酸氧化法制备(朱培坤等，1983;Nakane等，1974)。反应用5mg HRP 和 5mgAaH I,标记后用 SephadexG-75 把 HRP-AaH I 和游离 AaH I、HRP 分 开，洗脱液为0. 02mol/L PBS(pH7. 2),流速为8ml/h，每2. 5ml收集一管。
