蛇毒 变构蛇神经毒素及其他

一、对变构蛇神经毒素结构的研究

运动神经元病是一种严重威胁着人类健康的疾病。这种病发病缓慢，最初双手无力，随之 逐渐出现肌肉萎缩，最终全身肌肉萎缩，病多在3年〜4年内致残或致死。从1869年发现这种 病以来，人们对它进行了广泛的研究，取得了一定的进展。现在认为该病是运动神经元病变引 起的。对此病的治疗没有太大的进展，过去多用促肾上腺皮质激素和干扰素，虽然能获得近期效，但由于用量大、费用高，所以难以推广。变构蛇神经毒素是近年来应用较多的一种制剂， 它既克服了上述药品的缺点，又能使部分患者获得满意的近期疗效。

变构蛇神经毒素是一种复合物，它是由两种或两种以上具有神经毒素的蛇毒混合后 经处理而成，处理的方法主要是氧化修饰。蛇毒混合物经修饰后毒性明显降低，绝大部分 非神经毒组分变性失活，神经毒素的毒性也大大降低，但可能仍然具有和神经纤维进行作 用的能力，这种作用可能是变构蛇神经毒素对运动神经元疾病有疗效的原因所在。

用于实验室研究或临床应用的变构蛇神经毒素种类较多，制备方法和蛇毒组成也不 尽相同，但基本上可以分为国外的和国内的两类。国外以Sanders等(1978)的修饰方法为 主。他们以泰国眼镜蛇毒和台湾银环蛇毒为原料，用过氧化氢为氧化剂，加上其他辅助试 剂进行反应。有些人也用过氧甲酸、臭氧和N-溴代丁二酰亚胺作为氧化剂。Sanders等经 上述修饰制备的制剂称为修饰蛇神经毒素(MSNT)。他们控制反应程度的方法是用时间 长短来衡量，例如用于肌内注射的标准制剂修饰3天半，而静脉注射用的MSNT反应时 间为14天。国内以毛庆武等的方法为主。他们选用中华眼镜蛇毒代替泰国眼镜蛇毒，以 湖南或江西的银环蛇毒取代台湾银环蛇毒。为了弥补中华眼镜蛇毒中I型神经毒素不足 的问题，在配方中加进了一定量的I型突触后神经毒素。在控制修饰程度方面，毛庆武等 采用光谱分析测定蛇毒分子构象变化程度来确定反应时间，这样大大地提高了控制反应 的科学性。毛庆武等制备的这类制剂称为变构蛇神经毒素(ASNT)。

不管是Sanders等制备的修饰蛇神经毒素(MSNT)还是毛庆武等制备的变构蛇神经 毒素(ASNT)，其主要成分都是被修饰的神经毒素(NT)。其他毒素和酶蛋白几乎全部被 破坏，特别是蛇毒中的心脏毒素、细胞毒素、胆碱酯酶、PLA2和蛋白水解酶均被破坏，形 成沉淀物。对ASNT进行G-100凝胶过滤和CM-Sephadex C-25柱层析，可分离出两个 靠得很近的蛋白组分，其中一个组分为修饰后的神经毒素(NT)，这和用等电聚胶和凝胶 电泳结果一致，而未修饰前用相同的CM-Sephadex C-25层析能分出14个组分。除此之 外，和未修饰前相比，ASNT的N-末端氨基酸分析显示出6个〜7个不同末端的蛋白质 或多肽，这是修饰前后两种样品的又一大区别。

目前对ASNT的结构有了一定的研究，目的在于弄清它们的作用机制，以期望能更 有效地治疗运动神经元疾病。ASNT构象的研究多限于光谱分析。由于人们过去对眼镜 蛇毒和银环蛇毒中的NT构象进行了大量的研究，所以能通过比较得出ASNT的结构变 化。ASNT水溶液在波长280nm处的色氨酸及酪氨酸残基的紫外吸收峰明显减弱或完全 消失。ASNT的紫外光谱变化与Tu报道的用溴代丁乙酰亚胺氧化蛇毒NT的紫外光谱 特征基本一致。这种变化可能是由于NT中的色氨酸被氧化或羟基吲哚基所致，也可能是 由于修饰后NT发色基团转入分子内部而使吸收光减弱或消失。用荧光光谱法测定也得 出了相似的结论。ASNT中色氨酸残基的发射光谱完全熄灭，仅在波长320nm和390nm 处有一个微弱的发射光谱。这说明色氨酸残基几乎全部被修饰，而酪氨酸和苯丙氨酸还有 少部分保留。

毛庆武等还用偏振红外吸收光谱法测定ASNT的构象，发现ASNT中的NT仍然以 氧化型为主，只有少部分的甲硫氨酸和部分的二硫键被氧化修饰。《-银环蛇毒素分子中 Met27处于分子表面,卩-银环蛇毒素含有2个Met，也处在分子的表面，它们很容易被氧化 成亚砜，其表现为修饰后在1 060cm-1〜1 030cm—区出现亚砜伸展振动吸收峰。目前一致 的看法是ASNT中NT的二硫键没有太大的变化，肽键也没有断裂。

综上所述，MSNT或ASNT与原毒相比都有以下区别:①在组成上，由于修饰作用使 MSNT或ASNT的成分大大简化了，除残存少量的其他组分外，MSNT或ASNT的成分 主要是NT;②NT也和原毒不同，它是经过修饰的NT，毒性大大降低，修饰的侧链就目 前知道的主要是色氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等，二硫键一般不会解开，肽键也不 会断裂。因此，NT多部位侧链基团被氧化修饰是引起构象改变，导致生物活性和毒性改 变的主要原因。就ASNT的结构和活性的关系而论，现在尚缺乏必要的实验证据来说明 这类问题，这主要是因为ASNT的组成非单一以及作用复杂所致，对于ASNT的功能也 缺乏简便的测定方法。

二、对出血毒素构象的研究

由于出血毒素的分子量相对较大，有些还含有非蛋白成分(如多糖、脂），所以对它们 一级结构的研究不多。在高级结构方面也多限于对水溶液中构象变化的研究，下面举些实 例说明。

Bjarnason和Tu从西部菱斑响尾蛇蛇毒中纯化出5个出血组分，标 以a、b、c、d、e。毒素e的激光拉曼谱中1 655cm-1，1 665cm-1的双峰说明天然态的毒素e 混含有序和无序结构，去锌后毒素e的酰胺I谱带在1 655CHT1消失，相反，出现在 1 671cm-1处，揭示去锌毒素e的无序度增加。天然与去锌态的毒素e在230nm〜330mn 处的C. D谱中表现出显著的变化，推测锌存在于Tyr附近。当加锌重组后，重组毒素e的 C.D谱形近似天然状态，与此同时，活性也有部分恢复。同样，上述过程在275nm〜290nm 引起的紫外吸收变化证明锌和Tyr的酚基相连。

日本名古屋大学的研究小组以台湾尖吻蝮蛇蛇毒为原料，分离 出5种毒性组分，以ACl、AC2、AC3、Ac4、AC5命名。除Ac4仅有出血活性外，其余4种兼具 出血和致死活性，而且ACl活性还依赖Zn2+。ACl在与锌结合后的拉曼谱中，酰胺I谱带 呈现由1 665cm-1至lj 1 670cm-1的位移。在低频区观察到的奶此!!!-1谱带很可能是锌以 Tyr作为配位体的特征谱带。在许多金属酶中，His残基常作为配体，因此，Zn-N配位键 的可能性也不能排除。

徐洵等(1982)从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中分离出3种出血毒素，分 别命名为AaHI、AaHI和AaHM。前2种为酸性蛋白，后1种为碱性蛋白。3种出血毒 素的分子量都为22 000,都具有致死毒性、蛋白水解酶活性和纤溶活性。对AaH I的荧光光谱研究表明:谱在304nm的小肩反映了 Trp残基的存在。pH、温度、一定浓度的SDS、EDTA均可引起 AaH I荧光强度和出血活性的同步变化，I -和丙烯酰胺的淬灭研究证明Trp残基比较 接近分子表面。对AaH I的远紫外C.D谱呈215nm〜217nm的单负峰，为典型的卩-折叠 结构的图谱。AaH I在中性和弱酸性环境中稳定，当pH增加或pH<4. 0时，出血活性、纤

溶活性降低或消失。C.D谱支持这一结果：当pH>10. 0或pH<4. 0时，肽链有序度丧 失。但当溶液的pH从碱性(pHlO.O)回到中性(pH7.0)后，构象仍能恢复。AaH I的活性 对于金属离子Ca2+的依赖性也得到C.D谱有力的支持。AaHM的近紫外C.D谱的 294nm、275nm 2个负峰分别属于Trp的吲哚基和Tyr的酚羟基。在远紫外C. D谱中，存 在204nm〜208nm的1个较宽负峰。计算表明，中性条件下，AaH I含有43%的(3-折叠结 构和16%的《-螺旋结构，其余为无规则卷曲。经EDTA处理后的C D谱结果显示金属离 子在稳定蛋白质构象中起重要作用。有关出血毒素的化学修饰至今只有徐洵等(1985)做 了一些工作，她以皖南产尖吻蝮蛇狀扣奶)蛇毒中分离的出血毒素I(AaH I ) 为材料进行化学修饰研究.

AaH I共有7个组氨酸，当用DEP修饰后,AaH I的C. D谱 和荧光光谱没有改变，这说明修饰作用不改变AaH I的高级结构。AaH I活性的丧失是 由于直接对组氨酸修饰引起的。一般认为不可能3个组氨酸残基对AaH I活性都为必 需，但至少有1个残基是AaH I表现活性必需的。在PH4. 5条件下，NBS可修饰AaH I 中的Trp、Tyr和His,经修饰后，AaH I的活性也丧失。Trp被修饰的程度和AaH I活性 丧失大小没有比例关系。另一方面，二恶烷MNB-bromide都可以作用于Trp残基，但对 AaH I活性没有影响，这说明AaH I的失活与Trp残基被修饰无关。AaH I含有9个 Tyr，用乙酰咪唑修饰其中的2. 5个〜3. 0个Tyr残基，其活性不受影响。用TNM对 AaH I进行硝基化也不影响其活性，因此认为Tyr也不是AaH I表现活性所必需的，这 也就是说由NBS修饰3种残基引起的失活可能是因为修饰3组氨基酸残基的结果。综上 所述，对AaH I进行一系列化学修饰工作结果表明，AaH I的活性中心含有组氨酸残 基，而Tyr和Trp对活性中心无直接贡献。

三、舒缓激肽增强肽的结构特点

蛇毒中舒缓激狀增强肽(BPP)是含5个〜13个氨基酸残基的活性多肽，对血管紧张 素I转化酶有很强的抑制作用。BPP既能抑制激肽I增加舒缓激狀的作用，又能抑制血 管紧张素I，是一种有效的降压物质。

从1965年Ferreira在美洲矛头蝮蛇wmraoz)蛇毒中发现舒缓激肽增强肽 以来，1983年王茂音统计已阐明结构的BPP共计有13种，如表3-15-3所示。从表中可以 看出，BPP在结构上有共同点：它们的氨基酸残基数在5〜13之间，N-末端为焦谷氨酸， C-末端为脯氨酸。由于N-末端是焦谷氨酸，无法进行Edman降解，BPP中脯氨酸的含量 又很高，这给过去BPP的结构分析带来了很大困难。有趣的是它们含有谷氨酰胺和天门 冬氨酰胺，但是除了 N-端以焦谷氨酸存在的谷氨酸外，相对的谷氨酸和天门冬氨酸却极 少或没有，肽链中过多的脯氨酸又造成蛋白酶专一裂解的困难。

天然BPP大致可分为两类，即分子较小，仅为5肽的美洲矛头蝮蛇BPPa和肽链在10 肽左右的其他BPP。10肽左右的BPP的C-末端大多是以Ile-Pro-Pro结尾，只有2个例 外:一个是日本蝮蛇亚种蛇毒BPPA，其C-末端少1个脯氨酸，增强舒缓激肽的活力很低， 若人工合成其衍生物，并在C-末端多加1个脯氨酸，活力就增高200倍左右;另一个是日 本蝮蛇亚种BPPE，其C-末端为Ser-Pro-Pro,活力也同样很低，与组分BPPA的活力相接

近。这说明C-末端Ile-Pro-Pro结构是这一类BPP活力所必需的。

为了研究BPP结构与功能的关系，目前人工合成的各种BPP衍生物已有100种左 右，大致上也是按上述两类BPP(即美洲矛头蝮蛇BPP5a& BPP9a)的结构加以改变而合成 的。表3-15-4例举了几种有关的BPP类似物。可以看到，当BPP5a类似物N-末端的焦谷 氨酸残基被谷氨酸所取代，或此焦谷氨酸残基被移去，增强舒缓激肽的活力就明显下降, 说明此N-末端的焦谷氨酸残基对生物活力是有重要作用的。与此相反，1«^^的类似物 N-末端移去2个残基后，有的活力反而升高1倍左右。但两类BPP在结构与功能关系上 也有共同之处，如碱性氨基酸残基被取代后，活力都明显下降。

表3-15-4两类BPP类似物结构与功能的关系

一般认为BPP肽链越长，它产生的生理活性就越明显，起生理作用时持续的时间也 越长。这可能因为长链肽在体内被蛋白酶水解的要慢些，不易马上排出体外。对于能够抑 制血管紧张素转变的活性肽而言，如果肽链较长且分子的中间含有一些碱性氨基酸，那么 它对血管紧张素转变的抑制作用要强些。也有不少例外的情况。王茂音等(1983)对浙江 产蝮蛇G4. Zm/於 Pallas)蛇毒中提取的BPP;的结构和功能进行了研究，且BPP,的结构 已被测定出来(见表3-15-3)，当用焦谷氨肽酶移去BPP: N-末端的焦谷氨酸残基时，对舒 缓激肽的增强效应反而升高1倍左右，此后随着逐步进行Edman降解，活力也随之下降， 但降解至C-末端三肽时，生物活力仍保留约90%，至C-末端二肽时，活力就骤然丧失。对 BPP1 C-末端用羧肽酶水解时，lh后活力降低二分之一。这些都说明，BPPi C-末端结构的 完整是其生物活力所必需的。Squibb实验室人工合成了多种BPP类似物，其中类似于二 肽的SQ14 225(2-甲基-3-巯基丙酰-脯氨酸)却具有比天然BPP更高的活力，这种物质已 应用于临床治疗肾型高血压。这也间接说明，BPP的生物活性并不一定需要很长的肽链。 由此可见，有关BPP肽链长度、氨基酸组成和生物活性之间的关系是复杂的，只有在更深 入研究的基础上才能进一步弄清楚。