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治疗用抗蛇毒血清的制备

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   2015-04-06 10120
核心提示:目前世界上已有20多个国家30多个单位生产60多种治疗用的单价、双价和多价抗蛇毒 血清,计100多种,它是目前公认的治疗蛇伤的有效药物。药用抗蛇毒血清的制备在原理和基 本方法上与实验室研究用的抗蛇毒血清相似,但在选择动物和抗原等方面有些差异,这里就有 关差异的问题作些简单的介绍。

目前世界上已有20多个国家30多个单位生产60多种治疗用的单价、双价和多价抗蛇毒 血清,计100多种,它是目前公认的治疗蛇伤的有效药物。药用抗蛇毒血清的制备在原理和基 本方法上与实验室研究用的抗蛇毒血清相似,但在选择动物和抗原等方面有些差异,这里就有 关差异的问题作些简单的介绍。

抗原的选择与制备用作抗原的蛇毒一般选分布广、伤害人多、死亡率高并具有 抗原谱广(即具有区域代表性)的毒蛇蛇毒。这样的蛇毒制取的抗蛇毒血清不但能中和该 蛇毒,而且能中和其他相似毒蛇的蛇毒,具有很高的应用价值和经济效益。一旦选择好了 使用的抗原,下一步就应该对此制备蛇毒。用作抗原的蛇毒一般应由专人提取,商品蛇毒 往往因混有其他蛇毒或杂质而影响抗血清的制备。一般选择健康毒蛇,以咬皿挤压法采集 蛇毒,新鲜毒液经2 500r/min离心20min,取上清液冰冻干燥成粉状后备用。给动物进行 免疫之前,蛇毒必须经除菌处理,因为蛇毒经毒蛇的口腔排出时,常被一些致病微生物(如 葡萄球菌、链球菌、破伤风梭状杆菌和气性坏疽杆菌等以及脑炎病毒)污染。蛇毒是一种复 杂的混合物,一种蛇毒约含有5种〜15种酶,3种〜12种非酶蛋白和多肽以及至少6种 其他物质。同时,与毒性相关的往往是蛇毒中对热稳定的低分子量多肽,这类物质的抗原 性较差,若加大免疫剂量以增强免疫动物的刺激性,在免疫过程中会造成动物死亡。这个 问题可由两种方法解决,一是对抗原加佐剂以提高免疫作用;二是对抗原做减毒处理,使 之能用较大的剂量免疫动物而不会引起动物死亡。常用的佐剂有福氏佐剂、可溶性淀粉、 南洋面包木薯粉、可溶性羧甲基纤维素、氢氧化铝凝胶和海藻酸钠等。在制备抗蛇毒血清 时一般采用不完全的福氏佐剂,即羊毛脂和石蜡油。佐剂能增强免疫作用,一般认为它具 有推迟抗原的排泄、延长抗原刺激机体的时间,更主要的是它能激发网状内皮系统组织细 胞的增生,促进巨噬细胞的活力,因而能提高机体的免疫反应。抗原的减毒方法很多,目的 是减低抗原的毒性但不改变或基本不改变抗原的抗原性。在光氧化减毒、过氧化、氢氧化 减毒和福尔马林处理减毒等方法中,福尔马林处理减毒效果较好。在一'定浓度下,用福尔 马林处理2周,可使毒蛇的毒性大部分丧失而抗原性基本不变,这在免疫过程中将会得到 较为满意的效果。

动物免疫制备抗蛇毒血清用的动物可选用马或羊,最早有用羊为实验动物的, 但现在制备商品抗血清全都用马。这是因为马体型大,采血量多,易饲养,同时对蛇毒抗原 比较敏感。对马的选择主要是体型大而健壮,其他条件都是次要的。选择好的马需经过检 疫,因为有的马带有某种病菌,这样的马血清注入人体会带来不良的后果。

关于如何免疫动物才能获得好的效果,这与多种因素有关,各家都有自己的经验。一 般马经免疫后可多次放血,每次放血后再进行适当的免疫。对马初次免疫和采血后再免疫 的方法不同,初次免疫时常常分两步进行,即先给免疫动物注射少量的蛇毒后,让动物休 息2个月左右再进行正式免疫,剂量逐渐加大,每次间隔1周,直至免疫成功为止。对于注 射部位、免疫程序、抗原剂量、采血量、休息时间和马匹选择等都是应注意的重要因素。

马经免疫一段时间后,从颈静脉采取血样,测定血清(或血浆)的效价。测试数次后,若 试血结果已经达到要求的效价,则可于末次注射后数日内(通常1周)采血。试血的一般要 求为lml血清加lml含不同剂量蛇毒(LD5。或MID),混合后在37°C放置45min〜60min 后注射到体重20g的小鼠体内,以动物不死的蛇毒较高剂量为该血清试血效价,达到要求 效价水平,才可放血。放血从马颈静脉进行,以柠檬酸钠为抗凝剂。放血量的多少可根据 马体型的大小而定,一般可以放出8L〜10L血,隔3天可以再放一次血,以后休息。血液 经离心后分离出红细胞,血浆加防腐剂保存在2C〜lO'C暗处,自分离之日起至少要贮存 1个月,方可用于制备抗蛇毒血清。血细胞可以丢弃不用,也可以重新送回到原马的体内, 这样可以使马快速恢复健康,缩短          第二次采血的时间,但工作量较大,要无菌操作,否则会 给实验动物带来危害。

抗血清的提纯马血浆中含有多种蛋白质,这些蛋白质的含量很大,而有效成分 却较少。马血浆中的蛋白质属于异体蛋白,进入人体的量如过多就会使人产生不良反应, 如血清病和过敏反应等。另一方面,不加处理的血浆由于蛋白成分太多,容易变质,不易贮 存。现在一般的做法是对血浆进行提纯处理,提取出有效的免疫球蛋白IgG。不但如此,还 采用胃酶消化除去IgG分子中无中和毒素作用的Fc部分。抗蛇毒血清的提取方法基本 采用破伤风抗毒素生产方法,即采用胃酸消化、硫酸铵沉淀、明矾吸附等工艺,其工艺过程 分以下几步:

(1)消化加温:将免疫血浆稀释2倍〜3倍调至适宜的pH后,加入一定量胃蛋白酶和 甲苯,在一定温度下作用一定时间,然后加入15%硫酸铵,pH调至5. 0左右,加温至57€ 〜58'C 30min,冷却过滤,取滤液。


二次沉淀:将15%硫酸铵的滤液调pH至7. 2左右,加入20%硫酸铵使其沉淀。明矾吸附:将二次沉淀压干后进行明矾吸附,经过滤去其杂质,保留上清液^

最后将明矾吸附上清液加入38%硫酸铵进行沉淀,将沉淀压干透析,透析液加入 NaCl和防腐剂,经稀释至一定蛋白浓度后进行除菌处理,即谓半成品,经过严格质量检 验,合格后分装安瓿,便为抗蛇毒血清。

由上述方法制取的抗蛇毒血清称为精制抗蛇毒血清,是目前最普遍的一种。除精制抗 蛇毒血清外,还有原制抗蛇毒血清和浓制抗蛇毒血清。前种制品实际上未经提取,仅是将 免疫血清作除菌过滤的全血清。后种制品是用硫酸铵盐析法浓缩而成的,抗体可被中性盐 沉淀。在生产上常用硫酸铵从免疫动物的血浆中沉淀出含有抗体成分的球蛋白,再经透析 除去盐类,以纯化抗体。

比较上述3种制品的效价,则精制品高于浓制品,浓制品高于原制品。至于冻干抗蛇 毒血清,则是由这些制品经冰冻干燥而成的,并不是一类新的抗蛇毒制品。

 
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