蛇毒类毒素的人群免疫

第1年基础免疫2针(间隔3天〜4天），每针0. 5ml〜0. 7ml皮下注射。第2年加强 免疫1针，lml皮下注射。以后每3年〜5年加强注射1针，每次lml皮下注射。

安徽中医学院免疫研究室研制的吸附蝮蛇类毒素的检定规程草案和吸附蝮蛇类毒素 的使用说明书如下：

吸附蝮蛇类毒素检定规程草案

(―)定义和特性

吸附蝮蛇类毒素是蝮蛇毒素经甲醛脱毒后用磷酸铝吸附而成的不溶性制剂，它仍保留原抗原性，摇 动时成为乳白色均匀混浊悬液。

(二） 制备程序

材料干燥蝮蛇毒素。

起始脱毒溶液

蛇毒液配制：用新鲜的中性或弱酸弱碱性无菌生理盐水（或PH7. 0,66. 7mol/L PBS)，在无菌操 作下将竣蛇毒配制成10mg/ml(或2mg/ml)溶液。

脱毒和纯化：用低浓度甲醛在37’C中作用，使蝮蛇毒完全脱去毒性，无毒性检查按后述“(三)质 量标准检査”中“1.起始脱毒液检测标准”进行。

脱毒前或脱毒后纯化除去与出血毒和致死毒（主要为神经毒)等毒性无关的蛋白质成分更好。

类毒素应用液

浓度：高浓度的脱毒液用新鲜的中性或弱酸性无菌生理盐水稀释，使蛋白质含量为1.6mg/ml (如用2mg/ml蝮蛇毒脱毒，必须经无菌生理盐水透析后再配成1. 6mg/ml的浓度）。

除菌滤过:按后述“(三)质量标准检査”中“1.起始脱毒液检测标准”检定。

吸附蝮蛇类毒素用磷酸铝吸附10周〜12周，去上清液后加入无菌生理盐水，使最后蛋白质含 量为1.6mg/ml左右,再加入0.01%硫柳汞(W/V),再按后述“(三)质量标准检查”中“2.类毒素应用液 检测标准”检定。

(三） 质置标准检查

1.起始脱毒液检测标准

脱毒(无毒)检査：

致死毒素（主要为神经毒）:待检脱毒液0. 5ml做小白鼠(16g)腹腔注射，最少注射4只。饲养观察 2天，无任何蝮蛇毒的特殊中毒症状，或其他异常体征，为全脱毒。同时用经37€放置20天的脱毒液作 以上检查，也应无毒。

出血毒素:待检脱毒液0. lml做小白鼠（18g)—侧后肢肌肉注射(另一侧用0. lml无菌生理盐水 作对照），最少注射2只。饲养观察24h,局部无肉眼可见水肿和出血,表示完全脱毒，毒性逆转实验也为 阴性。

类毒素应用液检测标准

无菌实验:类毒素在铝盐吸附前，按常规法做需氧苗、厌氧菌、霉菌、支原体的无菌检查，应绝对 无菌生长。

纯度实验:用常规的半微量定氮法测蛋白质氮含量，蛋白质含量应为或接近1. 6mg/ml。

LF测定:用常规法检查，应不低于100LF/ml。

吸附蝮蛇类毒素成品检测标准

物理性状:振摇后为乳白色均匀悬液，无摇不散的凝块或其他异物。

pH:按常规法检查，应为pH6. 8左右。

磷酸铝含量:按常规法检查，应为lmg/ml(或5mg/ml)。

氯化钠含量:按常规法检查，应为0.85%〜0.9%。

甲醛含量:按常规法检查，应小于0. 02%。

硫柳汞含量:按常规法检查，应小于0.012%(W/V)。

含氮量:按常规法检查，应为或接近0. 256mg/ml。

无菌实验:按常规法检查，应无菌生长。

安全试验:①豚鼠:4ml吸附蝮蛇类毒素注射于2只成年豚鼠二侧腹壁皮下，每侧lml,同时用等 量无菌生理盐水每侧皮下注射做对照,2天内局部无红肿，豚鼠无任何中毒症状，2周内局部无组织坏死。

②小白鼠:0.5ml吸附类毒素作小白鼠(16g)腹腔注射,共注射4只，2天内无任何中毒症状,处死后 腹腔解剖无肉眼可见出血。病理切片检査，24h前仅可偶见由于吸附剂刺激出现极微的散在性点状出 血;24h后检查者即完全吸收。

效力试验:用豚鼠做中和抗体效价滴定。

材料:待检吸附蝮蛇类毒素;蝮蛇毒（目前尚缺少参考蝮蛇类毒素）。

实验方法:用0.3ml(或按对数系列的量)类毒素注射于豚鼠(300g〜400g)皮下,共注射15只（随 机分成10只为抗体测定组,5只为保护试验组），间隔4周后再重复注射一次，          第二次注射后4周，抗体 测定组的每只豚鼠抽血用血清固定法按前项测定血清中和抗体效价。另5只豚鼠用一定量蝮蛇毒攻击 (后肢肌肉注射)视其保护率。

判断标准:血清中和抗体效价均数应不低于0. 125mg/ml，保护性实验，应能完全保护1. 6mg蝮 蛇毒攻击的动物不死。

如有参考类毒素，应同时观察血清中和抗体效价和保护性实验，用数理分析比较二者有无差异，其 效力不应低于参考品。

(四） 储存和有效期

4X：保存，有效期3年。

(五） 人体使用方法

基础免疫:2针（间隔3月〜4月），每针0. 7ml皮下注射。

加强免疫:1针(基础免疫1年后），lml皮下注射。

吸附蝮蛇类毒素使用说明书

本品为蝮蛇类毒素加磷酸铝吸附剂制成。主要用于预防蝮蛇咬伤，对竹叶青、五步蛇等蝮亚科的毒 蛇咬伤也有一定的预防作用。

(一）接种对象

严重蝮蛇咬伤地区野外作业等有可能被蝮蛇咬伤的人群(主要是成年人）以及蝮蛇的专职饲养研究

(三） 禁忌

凡发热、急性传染病、肝病、心病、肾病、活动性结核、血液病（含出血性疾病）、中枢神经系统疾病后 遗症及有过敏史者不宜接种。

(四） 反应

注射本品后一般无反应，个别接种后可有红肿、疼痛、发痒或有低热、疲倦、头痛等，一般不需处理， 可自行消退。

(五） 注意事项

使用时应充分摇匀，如出现摇不散的沉淀颗粒，有异物、异色，安瓿有裂纹，封口不严，制品曾经冻 结，标签不清和过期者，均不可使用。

注射后，局部可能有硬结，1天〜2天即可吸收。注射          第二次应换另侧部位。

应预备1 : 1 000肾上腺素等急救药，供偶发过敏休克时急用。

(六） 保存和有效期

保存于4X：〜itrc冷暗处（防止冻结）》有效期3年。

五、蛇毒脱毒的有关问题

不同种蛇毒的化学组成和结构不同，因此用甲醛脱毒法制备类毒素时，脱毒的条件和 方法也要因蛇毒而异。目前有采用粗毒脱毒，也有采用毒素的组分脱毒，还有对蛇毒的不 同毒性成分采用不同的pH条件进行脱毒制备类毒素。甲醛对蛇毒的脱毒作用尚存在一 些问题:①脱毒的原理尚未完全清楚，不同毒性成分脱毒的机制可能不同。②脱毒不全，有 些蛇毒的毒性成分不易脱失。如彩锯鱗蝰蛇毒在很宽的pH范围内用甲醛处理，并不能使 其完全脱毒，但其层析的出血毒组分则可被脱毒;沙漠眼镜蛇蛇 毒也不能被甲醛脱毒。③有些蛇毒不易在同一 pH条件下使多种毒素成分同时脱毒。巴勒 斯坦蝰蛇的神经毒只有在pH偏碱性的条件下才被甲醛脱毒，而且脱毒后即失去抗原性， 而其出血毒组分只有在偏酸性的条件下脱毒才有抗原性。④易失去抗原性。蛇毒抗原性 较弱，蝮蛇毒1. 0%(W/V)以上甲醛处理后出血毒性和致死毒性消失，其抗原性显著降 低。另有一些蛇毒即使在低浓度的甲醛处理下，脱去毒性后同时也失去了抗原性。因此， 应用甲醛对不同科或种的毒蛇毒进行脱毒制备类毒素时，应探研出各自既可脱去毒性而 又不影响或基本上不破坏抗原性的脱毒方法。

蝮蛇毒素是多种小分子多肽和蛋白质的混合物，内含蛋白水解酶、精氨酸酯酶、磷酸 二酯酶、L-氨基酸氧化酶、碱性磷酸单酯酶、核糖核酸酶、5'-核苷酸酶、三磷酸腺苷敏、二 磷酸腺苷酶、核苷焦磷酸酶、磷脂酶八2、舒缓激肽释放酶、抗凝血活酶和纤溶酶等十多种 酶类，表现出以凝血失调、组织坏死和出血等毒性为主兼有神经毒性的特性。神经毒具有 不可逆性阻遏神经-肌肉接头的传递作用，毒性较强，具致死活性，是蝮蛇咬伤急性中毒引 起死亡的主要原因。本脱毒实验结果表明在一定浓度的甲醛作用下，蝮蛇毒的出血毒和神 经毒可被脱去。

在一定的甲醛浓度范围内，蝮蛇毒的脱毒与甲醛用量、蛇毒浓度、脱毒温度和脱毒所 需的时间有一定的关系。从图3-16-1和图3-16-2中可以知道蛇毒浓度越大，脱毒所需的 时间越长，呈正相关(P<0.05h0.2%〜0.5%甲醛(W/V)有很好的脱毒效果。lmg/ml蝮

蛇毒液在28‘C下脱毒时，甲醛浓度与脱毒时间呈负相关。r = 0. 9583,P<0. 05。而在37°C 温度下，0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml和3mg/ml的蝮蛇毒液，甲薛脱毒与其时间无明 显相关性。温度对甲醛的脱毒能力有很大关系，37°C比28°C有明显促进作用，脱毒的时间 约相差10倍。脱毒时弱酸或碱性环境(PH5. 2〜10)与脱毒能力无明显关系(表3-16-12)。 酸性能解除出血毒性，这与日本学者报道的在酸性(PH2. 7)条件下蝮蛇类蛇毒lh后出血 毒素即失活以及Moroz-Perlumtter等用甲醛对巴勒斯坦蝰蛇和彩锯鱗蝰蛇毒及其层析 组分的脱毒与pH有很大关系的报告基本相同。但可观察到，在PH3. 7的环境下，甲醛 长期脱毒制备的蝮蛇类毒素免疫动物，其保护率低于中性条件下脱毒者(P<0. 05)，而且 死亡小鼠腹腔皆有明显出血。说明该类毒素的出血毒性和神经毒性的免疫原性有所 降。

表3-16-12在不同PH条件下0. 2%甲醛(W/V)对2mg/ml蝮蛇毒脱毒能力

不同pH中致死毒素脱毒情况 不同pH中出血毒素脱毒情况

脱毒天数 （腹腔注射2天内，死亡鼠/注射鼠） （肌肉注射后24h局部出血情况）

因此，用酸性(PH<3. 7)来配合甲醛脱毒，应在出血毒性失活后立即纠正pH至弱酸 或中性，再继续进行致死毒素等的脱毒。日本学者曾用此法制备了蝮蛇类的蛇毒类毒素。

根据以上实验结果可知在弱酸、弱碱或中性的条件下，一定浓度甲醛可以使蝮蛇毒的 出血毒素和神经毒素等毒性完全脱失并可得到较好的免疫原性。以甲醛浓度而论,低浓度 对抗原性的破坏较小。从蛇毒的浓度来看，2mg/ml为佳，可以确保一定的抗原结合价。所 以我们采用0. 2%甲醛(W/V)在中性的环境中对2mg/ml蝮蛇毒素于37°C下处理9天进 行脱毒，制备了有一定免疫原性的吸附蝮蛇类毒素。