推广 热搜:

蛇毒蛋白的分离技术 分析性超速离心

中国较大的养蛇合作社?    
   2015-04-06 970
核心提示:在沉降速度实验中,若转速达到50 000r/min〜60 000r/min时,在溶液中分布均一的 高分子将以一定速度移向离心池底部,而离心池顶部溶液将由于溶质分子的丢失乃成为 仅有溶剂分子的上清液层。上清液层以下浓度均一的溶液部分称为“坪区(platean region)。

(一)沉降速度法

在沉降速度实验中,若转速达到50 000r/min60 000r/min时,在溶液中分布均一的 高分子将以一定速度移向离心池底部,而离心池顶部溶液将由于溶质分子的丢失乃成为 仅有溶剂分子的上清液层。上清液层以下浓度均一的溶液部分称为“坪区"(platean region) 在上清液层与“坪区”之间有一过渡区带 transition zone), 区带内的沉降物质的浓 度随着与旋转轴的距离不同而变化,这个区带称为“界面”(b0wndary),如图3-13-16 示。沉降速度法主要是利用光学方法来测量这种界面的移动,也即是测量坪区溶质分子的 移动。在沉降过程中,离心池内至转轴中心不同距离的溶液浓度不同,但通常应用的光学 系统并不直接记录浓度,而是记录浓度的变化(相当于折射率梯度的变化),这种沉降图像 的曲线峰形常用于观察沉降界面的移动以测定沉降物质的沉降系数和鉴定制备溶液中溶 质分子的均一程度,因为沉降系数与沉降分子的大小和形状有关,故利用这个方法测定分 子量还需要扩散系数。

如果溶质分子的密度比溶剂的密度为小,例如脂蛋白在浓的盐溶液中,在离心过程中溶质分子将上浮,即向着转轴中心移动,而在 离心池底部产生了纯溶剂层,因此测得的沉 降系数将是负值,超速离心的沉降谱线峰尖 是向下的。 若溶液中含有两种沉降速度不同的溶质 分子时,则在沉降过程中可能出现两个界面。 若有几个沉降速度不同的溶质分子存在时, 可能出现几个界面,从各个界面的移动,同样 也可测定不同溶质分子的沉降系数。溶液中 含有大量沉降系数不同的分子时,也可能只 得一个界面区,但这仅是代表不同的沉降分 子的连续分布。

(二)沉降平衡法

沉降平衡实验一般是在低速进行。例如对于分子量约为60 000的蛋白质分子进行沉降平衡实验仅需8 OOOr/min,在此情况下一方面沉降分子循离心方向向离心池移动的速度将很慢,另一方面由于溶质分子的部分 沉降产生浓度梯度而引起扩散,所以两个相反方向移动的溶质分子的量在适当时间有可 能相等并达到平衡状态。

在沉降实验的开始阶段,由于溶质分子的沉降,液面的浓度将减小,离心底部的浓度 将增加,然而由于反方向的扩散,溶质分子不会像在沉降速度法实验中那样离开液面而产 生上清液层,而是在液面维持一定的浓度。

在沉降平衡的早期阶段,近离心池中心部分(坪区)的溶液浓度与旋转轴中心的距离 无关.实际上与原来的浓度(c)相同,当实验进行时坪区渐消失,在离心池中 只有一个地方的浓度与原来的浓度相等,最后在相当长时间后达到平衡状态,离心池中各 部分的浓度不再随时间而变化。

在理想的沉降平衡条件下,最后液面的浓度将是原来浓度的一半,在离心池底部的浓 度将为原来浓度的1倍。测量在沉降平衡时溶质浓度的分布,即可直接计算分子量,并不 需扩散系数,这是与沉降速度法不同之处,但二者均需要溶质分子的微分比容数据。此法 的理论基础较好,但达到沉降平衡需时很长,有些实验需要数天,是其缺点。

近年来由于技术上的改进和理论上的进展,Archibald利用在沉降平衡的开始阶段、 坪区仍存在时的靠液面和底部的浓度梯度曲线直接计算分子量,可以节省很多时间。此新 方法有可能将与沉降速度法一样,成为常规使用的方法。

(三)沉降系数与分子量测定

在沉降速度实验中,溶质分子离开旋转轴中心I而移动。若转子旋转的角度为心则 离心加速度为作用于溶质分子上的离心力应是与其有效质量的乘积,有效质量 即是它的实在质量减去它所排开介质的质量。如果M为溶质的分子量,F为溶质分子的 微分比容,P为介质的密度,

 
反对 0举报 0 收藏 0 打赏 0评论 0
 
更多>同类养蛇技术
推荐图文
推荐养蛇技术
点击排行
网站首页  |  使用协议  |  版权隐私  |  关于我们  |  联系方式  |  网站地图  |  积分换礼  |  网站留言  |  RSS订阅  |  违规举报  |  湘ICP备15013970号-11